Государственный стандарт качества лекарственного средства. Фармакопейная статья "Вакцина сибиреязвенная живая"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Фармакопейная статья
"Вакцина сибиреязвенная живая"

Вводится впервые

Вакцина сибиреязвенная живая, лиофилизат для приготовления суспензии для подкожного введения и накожного скарификационного нанесения, представляет собой лиофилизированную в стабилизирующей среде взвесь живых спор вакцинного штамма Bacillus anthracis СТИ-1. Вакцина предназначена для профилактики сибирской язвы и вызывает формирование специфического иммунитета продолжительностью до 1 года.

Особенности производства

Вакцинный штамм B. anthracis СТИ-1 должен иметь типичные культурально-морфологические, биохимические и генетические свойства; должен обладать остаточной вирулентностью для морских свинок при введении им 50 млн. спор и белых мышей - 10 млн. спор; быть специфически безопасным для кроликов при введении им спор; индекс иммунитета для морских свинок должен быть не ниже 10000.

Перед приготовлением очередной серии вакцинного штамма проводят его анимализацию путем пассажа через организм морской свинки, с последующим отбором типичных колоний, выросших на плотной питательной среде при посеве селезенки.

Технология производства вакцины сибиреязвенной живой состоит из получения посевной культуры штамма B. anthracis СТИ-1, глубинного культивирования штамма B. anthracis СТИ-1 для получения нативной споровой культуры, приготовления концентрированной споровой взвеси с последующим розливом, замораживанием, сублимационным высушиванием, герметизацией и упаковкой препарата. На стадиях приготовления посевной и нативных культур определяют рН, концентрацию спор, спорообразование, отсутствие посторонней микрофлоры. В качестве вспомогательного вещества используется вещество, разрешенное к медицинскому применению - сахароза.

Испытание готового продукта

Описание. Пористая масса серовато-белого или желтовато-белого цвета с коричневатым оттенком.

Подлинность. Должна содержать чистую культуру вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1. Определение проводят при микроскопии мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену. В мазках из препарата должны наблюдаться овальные споры розового цвета с красным ободком по периферии.

Время растворения. Должна полностью растворяться течение 5 мин в 1 мл воды очищенной или в 1 мл 30% водного раствора глицерола при встряхивании. Растворенный препарат - непрозрачная гомогенная суспензия серовато-белого или желтовато-белого цвета без посторонних включений. Определяют визуально.

Время седиментационной устойчивости. Суспензия не должна расслаиваться в течение 5 мин.

Размер частиц. Суспензия должна свободно проходить в шприц через иглу N 0840. Определение проводят в соответствии ОФС "Инъекционные лекарственные формы".

рН. От 6,8 до 8,3. Определение проводят потенциометрически в соответствии с ОФС "Ионометрия". Для испытания используют содержимое 5 ампул препарата, разведенного в 30 мл 0,9% раствора натрия хлорида рН 7.1_0.1.

Средняя масса и отклонения от средней массы. Коэффициент вариации массы вакцины в ампулах (флаконах) должен быть не более 5%. Определение проводят весовым методом. 10 образцов без этикеток обрабатывают смесью спирта с эфиром и помещают в эксикатор на 3 ч. Ампулы (флаконы) вскрывают, взвешивают вместе с препаратом, затем удаляют содержимое и промывают водой. После этого ампулы (флаконы) выдерживают в сушильном шкафу при температуре 100-105°С до постоянной массы. По разности масс ампул с содержимым и без него находят массу вещества и рассчитывают коэффициент вариации (V) в процентах по формуле:

, где

S - стандартное отклонение;

- среднее арифметическое значение массы вещества в ампуле;

X - масса вещества в каждой ампуле;

n - число ампул.

Потеря в массе при высушивании. Не более 5%. Определение проводят в соответствии с ОФС "Потеря в массе при высушивании".

Отсутствие посторонних микроорганизмов и грибов. Вакцина не должна содержать посторонних микроорганизмов и грибов. Определение проводят в соответствии с ОФС "Стерильность" с использованием тиогликолевой среды.

Содержимое ампулы (флакона) ресуспендируют в 2-3 мл стерильного 0,9% растворе натрия хлорида. По 1 мл ресуспендированной вакцины и растворителя засевают в 2 пробирки с 20 мл тиогликолевой среды в каждой. Посевы инкубируют в течение 5-7 сут по одной пробирке из каждого образца при температуре °С для выявления аэробных и анаэробных микроорганизмов и по одной пробирке при температуре 20-22°С для выявления грибов.

Через 5-7 сут из каждой пробирки производят пересев по 0,5 мл на 2 пробирки, содержащие по 10 мл тиогликолевой среды и инкубируют при указанных выше температурах. Через 14 сут выращивания со дня первичного посева из всех пробирок делают мазки, окрашивают их по Граму, просматривают под микроскопом при увеличении К7х40.

Клетки сибиреязвенного микроба представляют собой неокрашенные споры и грамположительные палочки, различающиеся по размерам (мелкие, средние и крупные) и по форме (продолговатые или раздутые), расположенные поодиночке или в виде коротких и длинных цепочек.

В случае обнаружения хотя бы в одном из 10 просмотренных полей зрения грамотрицательной микрофлоры или грамположительных кокков, препарат считается загрязненным посторонней микрофлорой. Если в повторном испытании результат будет таким же, препарат считают не выдержавшим испытание.

Специфическая безопасность. Вакцина должна быть безопасна. Испытание проводят на 2 кроликах массой 2,0-2,5 кг. Животных взвешивают и измеряют температуру в течение 3 сут и за 30 мин до проведения испытания.

Вакцину вводят подкожно в область внутренней поверхности бедра в дозе 250 млн. спор от общей концентрации. Наблюдение проводят в течение 10 сут. Вакцина не должна вызывать гибели животных, на месте введения не должен развиться некроз или инфильтрат. Допускается падение массы тела животного до 10% от исходной величины в течение первых 8 сут и повышение температуры тела не более, чем на 1°С на 1-2 сут после введения вакцины.

Специфическая активность.

1. Общая концентрация спор (ОК). Общая концентрация спор в зависимости от содержания человеко-доз должна составлять 8-12 млрд. спор/мл или 4-6 млрд. спор/мл в ампуле (флаконе). Концентрацию спор определяют методом подсчета в камере Горяева. Содержимое ампулы с вакциной ресуспендируют в 1 мл дистиллированной воды и делают последовательные десятикратные разведения в дистиллированной воде до исчезновения в последней пробирке отчетливо видимой мутности. Взвесью спор из этого разведения заполняют камеру Горяева и через 5-10 мин с помощью микроскопа с фазово-контрастным устройством (объектив x40, окуляр x7) подсчитывают количество спор в 10 больших квадратах сетки. Число спор в 1 ампуле (1 мл) исходной вакцины определяют по формуле:

,

где ОК - общее число спор, спор содержащие в ампуле (мл);

n - количество спор в 10 больших квадратах;

p - кратность разведения;

25000 - постоянная величина для камеры данного типа.

2. Количество живых спор. Количество живых спор должно составлять не менее 40% от общей концентрации.

В исследованиях используют агар Хоттингера (аминный азот  мг%) рН или мясопептонный агар (МПА) рН .

При определении содержания живых микробных клеток в вакцине используют концевые химически чистые пипетки и пробирки со стерильной дистиллированной водой, которые должны быть охлаждены до температуры °С.

Содержимое каждой из трех ампул ресуспендируют в 1 мл стерильной дистиллированной воде, встряхивают до образования гомогенной взвеси. Содержимое каждой ампулы с помощью стерильных пипеток переносят в три стерильные колбы вместимостью 250 мл с 99 мл дистиллированной воды и фарфоровыми или стеклянными бусами и закрывают ватно-марлевыми пробками. Колбы помещают на шуттель-аппарат и выдерживают в течение 30 мин при температуре °С и 50 покачиваний в минуту.

Исходя из концентрации спор, определенной в камере Горяева, взвесь спор десятикратно разводят в дистиллированной воде до содержания, примерно, 1000 спор в 1 мл. (Например, из взвеси спор, разведенной в колбе в 100 раз, делают 5 последовательных десятикратных разведений, используя для каждого разведения отдельную пипетку вместимостью 1 мл, получая кратность разведения равной 10000000).

Из разведения, содержащего около 1000 спор в 1 мл, засевают по 0,1 мл на 5 чашек Петри с питательной средой, равномерно распределяя стеклянным шпателем или методом покачивания по поверхности питательной среды. Чашки инкубируют при температуре °С в течение 24-36 ч агаром вверх, после чего подсчитывают число выросших колоний на каждой чашке Петри.

Расчет концентрации живых спор в 1 мл вакцины проводят по формуле:

,

где БК - концентрация живых спор в 1 мл пробы, спор/мл;

2 - коэффициент пересчета на 1 мл пробы;

n - общее число колоний, выросших на 15 чашках при высеве 0,5 мл каждой из трех исследуемых проб;

p - кратность разведения.

Процент живых спор вычисляют по формуле:

3. Иммуногенность для морских свинок. Индекс иммунитета должен быть не менее 10000 (отношение величины заражающего тест-штамма B. anthracis 71/12 для иммунизированных животных к величине для неиммунизированных животных).

20 морских свинок обоего пола массой  г иммунизируют вакциной однократно подкожно в область внутренней поверхности бедра в дозе 50 млн. спор в объеме 0,5 мл. Одновременно 20 неиммунизированным морским свинкам вводят по 0,5 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида. Через 21 сут иммунизированных и неиммунизированных животных подкожно инфицируют тест-штаммом B. anthracis 71/12. Для заражения иммунизированных животных используют дозы и , разведенные из общего количества спор, для неиммунизированных животных - и , разведенные из общего количества спор. Каждую заражающую дозу вводят в объеме 0,5 мл 5 иммунизированным и 5 неиммунизированным морским свинкам. За животными наблюдают в течение 10 сут, после чего рассчитывают величины заражающей тест-культуры для иммунизированных и неиммунизированных животных.

Растворители, выпускаемые в комплекте с препаратом. 30% раствор глицерола в воде для инъекций.

Маркировка и упаковка. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты (средства)".

Хранение. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные средства".