Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья ОФС 42- "Определение концентрации микробных клеток"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Общая фармакопейная статья ОФС 42-
"Определение концентрации микробных клеток"

Вводится впервые

В процессе выполнения микробиологических исследований возникает необходимость использования взвесей микроорганизмов, содержащих определенное количество микробных клеток.

При определении количества клеток в суспензиях (взвесях) требуется правильное измерении как концентрации клеток, так и установление процентного содержания жизнеспособных клеток.

Концентрация микробных клеток выражается числом клеток определяемых микроорганизмов (включая нежизнеспособные и поврежденные) на единицу объема суспензии.

Жизнеспособность выражается числом жизнеспособных клеток на единицу объема суспензии (число колониеобразующих единиц в мл - КОЕ/мл).

Процедура подсчета клеток в лабораторных условиях может выполняться вручную или с помощью автоматических устройств, позволяющих определить концентрацию микробных клеток. Различают методы прямого визуального подсчета, подсчета колоний после высева микроорганизмов на питательные среды, а также определение количества микробных клеток под микроскопом после окрашивания определенными красителями. Кроме того, для подсчета могут применяться коммерческие водорастворимые системы, содержащие стандартизованное количество микробных клеток. Современные коммерческие системы просты в использовании и позволяют снизить случайную погрешность при определении концентрации микробных клеток, связанную с человеческим фактором.

1. Методы прямого подсчета

Методы прямого подсчета дают возможность учесть численность микроорганизмов наиболее полно. Их эффективность гораздо выше, чем метода высева, так как многие микроорганизмы требовательны к условиям культивирования и качеству питательной среды. Методы прямого подсчета дают возможность получить дополнительную информацию о размерах и морфологии исследуемых клеток.

1.1. Подсчет в счетной камере

Наиболее распространенным методом определения общего числа клеток в 1 мл суспензии является их подсчет под микроскопом с использованием счетной камеры. Существует несколько видов счетных камер, принципиальное устройство которых одинаково: Тома-Цейса, Бюркера, Горяева, камера подсчета с сеткой Нейбауэра.

Счетная камера Горяева представляет собой специальное предметное стекло, в центральной части которого имеется углубление, глубина которого во всех своих частях одинакова. На дне этого углубления выгравирована сетка, разделенная на квадраты определенной площади.

По обе стороны от центрального углубления расположены две другие площадки с уровнем на 0,1 мм выше. Их плоскости служат для притирания покровного стекла до появления так называемых Ньютоновских колец.

После притирания покровного стекла создается камера, закрытая с двух боковых сторон, а с двух других имеющая капиллярные пространства, через которые камеру заполняют разведением взвеси микроорганизма с помощью пастеровской пипетки (рис.1).

Подсчет клеток проводят под микроскопом, который настраивают таким образом, чтобы была видна нанесенная на камеру сетка и клетки микроорганизма, равномерно распределенные на ней. Считают число клеток в 5 горизонтальных и 15 диагональных ячейках, после чего по формуле определяют число клеток в 1 мл исследуемой взвеси.

, где:

x - число клеток в 1 мл исследуемой взвеси;

a - число клеток в 20 квадратах;

b - разведение исходной взвеси микроорганизма.

При подсчете с использованием камеры необходимо соблюдать следующие основные правила:

- Используют только стандартные покровные стекла.

- По возможности подсчитывают микробные клетки в 100 ячейках.

- Проводят подсчет только чистых культур.

- Избегают недозаполнения и переполнения камеры.

1.2.Подсчет клеток на мембранных фильтрах

Этот метод рекомендуется использовать для определения количества микроорганизмов во взвесях с низкой концентрацией клеток.

Определенный объем исследуемой суспензии фильтруют через мембранный фильтр с нанесенной сеткой. Размер пор фильтра 0,22 или 0,45 мкм. Микроорганизмы на фильтре окрашивают карболовым эритрозином и подсчитывают в 20 полях зрения с помощью микроскопа, оснащенного окулярным микрометром. Расчет общего количества микроорганизмов в 1 мл (X) проводят по формуле:

, где:

Х - общее количество микроорганизмов в 1 мл;

S - фильтрующая площадь ;

- переводной коэффициент квадратных миллиметров в квадратные микрометры;

N - среднее количество бактерий в одном квадрате;

s - площадь квадрата окулярного микрометра ;

V - объем профильтрованной жидкости (мл).

При подсчете клеток на мембранных фильтрах с помощью люминесцентного микроскопа используют нелюминесцирующие фильтры. После концентрирования клеток на их поверхности проводят флюорохромирование акридиновым оранжевым и подсчитывают. Этот метод позволяет подсчитать общее количество микроорганизмов и определить количество жизнеспособных клеток, так как при окрашивании акридиновыми красителями жизнеспособные клетки имеют зеленую, а нежизнеспособные - красную окраску.

2. Методы непрямого определения концентрации клеток микроорганизмов

К непрямым методам определения концентрации клеток микроорганизмов относятся визуальные методы, методы, основанные на светопоглощении (турбидиметрия), светорассеянии (нефелометрия), электропроводности микробных взвесей (кондуктометрия) и др.

Рост микроорганизмов в питательной среде обычно приводит к изменению ее мутности.

Мутность - это способность оптически неоднородной среды рассеивать проходящий свет. Мутность взвесей микроорганизмов является оптическим эквивалентом концентрации содержащихся в них микробных клеток. Мутность зависит как от свойств микроорганизмов (размер, показатель преломления), так и от их количества в единице объема. Мутность микробных взвесей определяют путем сравнения со стандартными образцами мутности визуальным методом.

2.1. Турбидиметрия и нефелометрия

Мутность микробной взвеси может быть точно определена путем измерения оптической плотности при определенной длине волны.

Интенсивность пучка света, проходящего через пробу, уменьшается за счет рассеивания (нефелометрия) и поглощения света (турбидиметрия). Светорассеяние и светопоглощение зависят не только от количества клеток в суспензии, но также от их размеров и формы.

Для более концентрированных взвесей обычно применяют турбидиметрический метод. Для очень разбавленных суспензий используют метод нефелометрии в виду его большей чувствительности. Действие нефелометра основано на сопоставлении интенсивности света, рассеянного средой, с интенсивностью рассеяния эталона.

При испытании пробу освещают интенсивным потоком, а затем измеряют интенсивность прошедшего излучения или излучения, рассеянного под определенным углом. Для определения количества клеток в среде используют калибровочную кривую, отображающую зависимость между величиной светорассеяния и числом клеток в единице объема взвеси. Для построения калибровочной кривой измеряют величину светорассеяния в ряде проб с известным содержанием клеток. Калибровочные кривые индивидуальны для каждого микроорганизма.

Возможно использование автоматических систем - анализаторов для измерения оптической плотности взвесей микроорганизмов.

2.2. Визуальный метод

Для определения концентрации микроорганизмов может быть использован метод, основанный на визуальном сравнении мутности исследуемой взвеси со стандартным образцом мутности.

Визуальные методы оптической стандартизации микробных взвесей основаны на принципе установления равенства показателей мутности двух сред - исследуемой взвеси и стандартного образца мутности. Для этого исследуемую взвесь и стандартный образец сравнивают между собой в проходящем или отраженном свете с помощью специальной сравнительной таблицы. Если при одинаковом освещении видимость просвечивающихся через пробирки с исследуемой взвесью и стандартным образцом линий видимых элементов сравнительной таблицы одинакова, то считают, что мутность исследуемой взвеси равна мутности стандартного образца. Зная показатель мутности стандартного образца и его числовой микробный эквивалент, рассчитывают концентрацию микробных клеток в исследуемой взвеси.

2.2.1. Международный стандарт мутности Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ)

Международный стандарт мутности - это утвержденный ВОЗ первичный эталон мутности для оптической стандартизации бактериальных взвесей, соответствующий мутности взвеси бактерий Борде-Жангу, содержащей 109 клеток в 1 мл, т. е. равный 10 единицам (ЕД) мутности.

2.2.2. Отраслевые стандартные образцы мутности.

Отраслевые стандартные образцы мутности (ОСО мутности) предназначены для обеспечения единства определения концентрации микробных клеток в бактерийных взвесях при микробиологических исследованиях.

ОСО мутности изготовлены на основе мелкодисперсной взвеси стекла марки Pyrex и зарегистрированы в Реестре отраслевых стандартных образцов как ОСО 42-28-84 (20 МЕ), ОСО 42-28-85 (10 МЕ), ОСО 42-28-86 (5 МЕ) соответствующего года выпуска.

ОСО мутности аттестованы с использованием Международного стандартного образца мутности ВОЗ (INTERNATIONAL REFERENCE PREPARATION OF OPACITY, World Health Organization International Laboratory for Biological Standard, National Institute for Biological Standards and Control, London, England), которому присвоен показатель 10 международных единиц (МЕ). Этот показатель является относительным: одна международная единица соответствует мутности взвеси коклюшных бактерий, содержащей клеток в 1 мл.

Мутность ОСО, равная 10 международным единицам (МЕ) мутности, ориентировочно соответствует следующим концентрациям клеток в 1 мл:

 клеток/мл для микробов кишечной группы;

клеток/мл для микробов коклюшной группы;

клеток/мл для бруцеллезных микробов;

клеток/мл для холерного вибриона;

клеток/мл для туляремийных микробов.

Для проведения испытания с использованием ОСО работают с пробирками, поставляемыми в комплекте с ОСО мутности, или идентичными по своим характеристикам (марка стекла, показатель преломления стекла, внутренний объем, толщина стенки).

Исходную взвесь микроорганизмов разводят стерильным 0,9% раствором натрия хлорида до тех пор, пока ее мутность не будет равна мутности стандартного образца, что определяют в соответствии с инструкцией по применению ОСО мутности по специальной сравнительной таблице.

Исследуемую микробную взвесь перемешивают встряхиванием или пипетированием в стерильной емкости до гомогенного состояния и переносят в пробирку, входящую в комплект с ОСО мутности, в объеме 6 - 7 мл, что соответствует объему жидкости в пробирке с ОСО.

Перед началом измерения стандартный образец осторожно встряхивают в течение 10-15 секунд до полного исчезновения осадка. Если после встряхивания в пробирке с ОСО мутности остается видимый глазом осадок, ее изымают из обращения.

Совмещают пробирки с ОСО мутности и исследуемой взвесью микроорганизмов в вертикальном положении на уровне глаз, плотно прикладывают пробирки к сравнительной таблице и освещают источником рассеянного света таким образом, чтобы пробирки не экранировали друг друга от источника света. Источником света могут служить: люминесцентная лампа мощностью от 20 до 40 Вт, лампа накаливания матовая или с матовым фильтром (плафоном) мощностью от 40 до 60 Вт, рассеянный дневной свет. Проводить испытания при прямом солнечном свете не допускается. Испытания должен проводить оператор с остротой зрения 1,0.

В случае одинаковой четкости видимых элементов сравнительной таблицы через пробирку с ОСО и пробирку с исследуемой микробной взвесью, мутность их считают одинаковой и равной мутности, указанной на этикетке ОСО.

Погрешность визуального определения мутности с помощью ОСО составляет около 10%.

Формулу расчета общей концентрации микробных клеток приводят в частной фармакопейной статье.

Пример определения общей концентрации (ОК) микробных клеток в вакцине туляремийной живой сухой. Определение проводят, используя не менее чем три образца.

При доведении мутности исследуемой взвеси до мутности, соответствующей 10 МЕ к 0,5 мл ресуспендированной вакцины ( мл) последовательно добавили порциями по 1,0 мл, 0,2 мл, 0,3 мл ( мл) стерильного 0,9% раствора натрия хлорида. Концентрация исследуемых микробных клеток, соответствующих 10 МЕ, составляет , КОЕ/мл.

Расчет проводили по формуле:

, где:

OK - общая концентрация микробных клеток;

- объем исходной взвеси, мл;

 - объем стерильного 0,9% раствора натрия хлорида, использованного для разведения исходной взвеси, мл;

k - коэффициент, концентрация исследуемых микробных клеток, соответствующая 10 МЕ (приведен в инструкции по применению ОСО), КОЕ/мл.

Таким образом: мк./кл./мл.

Итоговое значение общей концентрации микробных клеток рассчитывают как среднее арифметическое значений ОК по трем образцам.

2.2.3. Стандарт мутности Мак-Фарланда (McFarland)

Другим примером стандартизации по мутности микробной взвеси является использование стандарта Мак-Фарланда (McF). Согласно методике изготавливают 1% растворы бария хлорида и серной кислоты. Для приготовления стандарта мутности и взвеси микроорганизмов, подлежащей исследованию, подбирают пробирки одного диаметра. В пробирки изготавливаемого стандарта разливают 1% раствор серной кислоты в объеме, указанном в таблице 1, и к ней добавляют 1% раствор бария хлорида для получения общего объема 10 мл. Пробирки с изготовленным стандартом герметично закрывают. Жидкость в стандарте Мак-Фарланда и исследуемой пробирке должна быть гомогенно мутной.

Внимание! Бария хлорид, серная кислота - ядовитые вещества.

Количественную характеристику исследуемой микробной взвеси определяют сравнением с ближайшими по мутности пробирками тем же способом, как при использовании ОСО 42-28-85 соответствующего года выпуска с учетом данных, приведенных в таблице 1. Методика не предназначена для определения общей концентрации микробных клеток в бактерийных взвесях при производстве и контроле иммунобиологических лекарственных препаратов.

Таблица 1 - Количественная оценка бактериальных взвесей по шкале Мак-Фарланда

Номер по шкале Мак-Фарланда	Объем, мл		Приблизительное количество КОЕ/мл	Соответствующая микробная взвесь, х КОЕ/мл
	1%	1%
0,5	9,95	0,05		1,5
1	9,9	0,1		3
2	9,8	0,2		6
3	9,7	0,3		9
4	9,6	0,4		12
5	9,5	0,5		15
6	9,4	0,6		18
7	9,3	0,7		21
8	9,2	0,8		24
9	9,1	0,9		27
10	9,0	1,0		30

2.3. Кондуктометрические методы

Кондуктометрические методы основаны на зависимости сопротивления или проводимости среды от концентрации клеток. При росте и размножении в соответствующей питательной среде микроорганизмы продуцируют высокозаряженные ионные метаболиты, что приводит к изменению электрохимических свойств среды. Эти изменения полного сопротивления, измеряемые проводимостью или емкостным сопротивлением, регистрируются электродами, находящимися в контакте с культуральной средой. Время определения обратно пропорционально концентрации микробных клеток в суспензии. Для дрожжевых и плесневых грибов, которые вызывают только незначительные изменения электропроводности, обычно применяют косвенные методы измерения проводимости с использованием источника гидроксида калия, однако прямые измерения также могут быть применены.

Одним из таких методов является подсчет числа клеток в электронном счетчике Култера. Суспендированные в электролите клетки проходят через апертуру малого диаметра, расположенную между двумя электродами. Когда клетки проходят через апертуру ("электрочувствительную зону"), каждая из них вытесняет определенное количество электролита, вызывая возрастание сопротивления. В результате происходит небольшое изменение величины электрического тока в усилителе, который преобразует колебания силы тока в импульсы напряжения, которые находятся в прямой зависимости от размера прошедшей через апертуру клетки.

К преимуществам данного метода относится возможность подсчета общего количества клеток, получение подробной информации о популяции клеток без проведения дополнительных исследований, определение распределения клеток популяции по размерам.

Однако, счетчик Култера не позволяет отличить жизнеспособные клетки, так как фрагменты клеток также генерируют импульсы, которые могут давать ложноположительные результаты.

После выполненной валидации кроме вышеупомянутых методов могут быть использованы аденозин трифосфат (АТФ) биолюминесценция, цитометрия и колориметрический метод определения роста микроорганизмов.

3. Методы определения жизнеспособных клеток микроорганизмов

3.1. Метод мембранной фильтрации

С помощью мембранной фильтрации может быть определено как общее количество клеток, так и количество жизнеспособных микроорганизмов. В последнем случае после проведения фильтрации мембранный фильтр помещают на соответствующую плотную среду. После стандартной инкубации видимые колонии подсчитывают. Метод мембранной фильтрации аналогичен методу подсчета клеток на чашках, но является более чувствительным, поскольку через фильтр можно пропускать большие объемы исследуемого материала.

3.2.Высев на питательные среды

Сущность метода заключается в посеве определенного объема разведения суспензии микроорганизмов на плотную питательную среду, инкубации и подсчете образовавшихся колоний, считая, что каждая колония - результат размножения одной жизнеспособной клетки микроорганизма.

Посев осуществляют одним из чашечных методов, указанных в разделе "Микробиологическая чистота", а именно: глубинным, поверхностным, двуслойным или модифицированным агаровым методом.

При учете результатов определяют среднее количество колоний в каждом разведении, для чего используют результаты параллельных высевов. Для получения достоверных результатов отбирают чашки, где число колоний бактерий находится в пределах от 30 до 300, а колоний грибов - от 10 до 100.

Если чашки из двух последовательных разведений попадают в эту область, количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл рассчитывают как их среднее значение.

Для расчета применяют уравнение:

N - среднее количество КОЕ в 1 мл;

c - сумма подсчитанных колоний на всех чашках;

- количество чашек первого разведения;

- количество чашек второго разведения;

d - коэффициент разведения первого разведения.

Пример:

В двух последовательных разведениях и были получены результаты: 168 и 215 и 14 и 25 соответственно.

Количество микроорганизмов в исходной суспензии равно:

(КОЕ/мл)

3.3. Окраска селективными красителями

Данное исследование основано на отсутствии красителя в жизнеспособных клетках, тогда как мертвые или поврежденные клетки адсорбируют краситель и окрашиваются. Результаты испытания обеспечивают информацию о целостности цитоплазматической мембраны, однако эти результаты не всегда отражают функциональность клеток. Наиболее часто используемые красители - трипановый синий, эритрозин В или нигрозин. Оптимальное значение рН 7,5. Концентрация красителя и время окрашивания валидируются. В большинстве случаев используется 0,1% или 0,5% р-р трипанового синего в стерильном фосфатном буферном физиологическом растворе. Приготовленный раствор красителя хранят в защищенном от света и воздуха месте.

Окрашивание клеточной суспензии, например раствором трипанового синего проводят, осторожно смешивая краситель с суспензией микробных клеток. Выдерживают в течение 2-4 мин. при комнатной температуре. Далее перемешивают и помещают в счетную камеру. Подсчет проводят незамедлительно. Необходимо, чтобы время контакта клеток с красителем при окрашивании составляло не более 4 мин., так как увеличение времени экспозиции с красителем значительно увеличивает количество окрашенных клеток.

Процентное содержание жизнеспособных клеток определяют как отношение числа неокрашенных (живых) клеток к общему числу клеток под оптическим микроскопом, учитывая как все неокрашенные (живые), так и все окрашенные (мертвые) клетки. Жизнеспособность (%) определяется по формуле:

, где:

Х - процентное содержание жизнеспособных клеток,

n - число неокрашенных жизнеспособных клеток,

N - общее число клеток.