Государственный стандарт качества лекарственного средства. Фармакопейная статья ФС 42- "Вакцина дизентерийная против шигелл Зонне липополисахаридная"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Фармакопейная статья ФС 42-
"Вакцина дизентерийная против шигелл Зонне липополисахаридная"

Вводится впервые

Вакцина дизентерийная против шигелл Зонне липополисахаридная, представляет собой раствор липополисахарида (ЛПС), извлечённого из культуры Shigella sonnei, очищенного ферментативными и физико-химическими методами.

Технология получения вакцины дизентерийной против шигелл Зонне липополисахаридной предусматривает культивирование производственного штамма в жидкой синтетической питательной среде, выделение из полученной биомассы неочищенного липополисахарида, лиофилизацию неочищенного липополисахарида, его очистку, лиофилизацию очищенного липополисахарида.

Производственный штамм Shigella sonnei должен отвечать следующим требованиям:

- на плотной питательной среде образует круглые с ровными краями выпуклые колонии (S-формы);

- в мазках, окрашенных по Граму должны быть грамотрицательные палочки;

- не должен ферментировать сорбит, дульцит, глюкозу и сахарозу;

- не должен образовывать индол;

- должен расщеплять ксилозу, арабинозу, сбраживать рамнозу, лактозу;

- не должен образовывать сероводород;

- вирулентность штамма, при внутрибрюшинном заражении белых беспородных мышей , должна быть не выше 50 млн микробных клеток ;

- должен давать положительную кератоконьюнктивальную пробу на морских свинках.

Производство

Технология получения вакцины дизентерийной против шигелл Зонне липополисахаридной предусматривает культивирование производственного штамма в жидкой синтетической питательной среде, выделение из полученной биомассы неочищенного липополисахарида, лиофилизацию неочищенного липополисахарида, его очистку, лиофилизацию очищенного липополисахарида.

Производство вакцины включает в себя следующие этапы:

- получение биомассы и ее дезактивация;

- получение неочищенного липополисахарида (ЛПС);

- лиофилизация неочищенного липополисахарида;

- очистку липополисахарида и его лиофилизацию;

- получение готовой формы препарата.

На этапе культивирования используют синтетическую питательную среду. Полученную биомассу контролируют на бактериологическую чистоту и типичность морфологии. Инактивацию проводят формалином с массовой долей формальдегида не менее , до конечной концентрации 0,5%. Контроль инактивации проводят методом посева на МПА и среду Эндо.

Полученную инактивированную культуральную жидкость центрифугируют, раствор неочищенного липополисахарида подвергают диализу. ЛПС лиофилизируют, в полученном препарате липопополисахарида исследуют О - специфическую активность.

Этап очистки ЛПС предусматривает очистку от нуклеиновых кислот, балластных белков и диализ. Лиофильно высушенный препарат очищенного липополисахарида - субстанция для приготовления готовой формы препарата.

Испытания субстанции.

Описание. Белый аморфный порошок.

Подлинность. Субстанция (0,01% раствор) образует одну линию преципитации с сывороткой кроличьей против липополисахарида Shigella sonnei. Определяют в реакции преципитации в геле по Оухтерлони с сывороткой кроличьей против ЛПС S. sonnei (см. тест "Подлинность" в разделе "Испытания готового продукта").

Белок. Не более 2,0%. Испытания проводят по методу Бредфорда без предварительного осаждения белка в соответствии с ОФС "Определение белка". Субстанцию предварительно растворяют в воде очищенной до концентрации 5 мг/мл лиофилизата в объеме растворителя.

Нуклеиновые кислоты. Не более 2,0%. Испытания проводят методом Спирина в соответствии с ОФС "Определение нуклеиновых кислот по методу Спирина". Субстанцию предварительно растворяют в воде очищенной до концентрации 1мг/мл лиофилизата в объеме растворителя.

Молекулярные параметры. Не менее 50% липополисахарида должно элюироваться в объеме до Kd=0,5. Определяют методом гель-фильтрации. (см. тест "Молекулярные параметры" в разделе "Испытания готового продукта").

Специфическая активность. 0,01% раствор субстанции должен тормозить реакцию пассивной гемагглютинации с сывороткой диагностической к шигеллам Зонне неадсорбированной в концентрации не выше 6,25 мкг/мл; при отсутствии торможения с сывороткой диагностической к шигеллам Флекснера неадсорбированной в концентрации менее 25 мкг/мл (см. тест "Специфическая активность" в разделе "Испытания готового продукта").

Пирогенность. Субстанция должна быть апирогенной. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Пирогенность". Тест-доза 0,050 мкг/мл в 1,0 мл раствора натрия хлорида 0,9% на 1,0 кг массы животного.

Аномальная токсичность. Субстанция должна быть нетоксичной. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Аномальная токсичность" (Тест для вакцин и сывороток). Готовят раствор субстанции в концентрации 100,0 мкг в 1,0 мл раствора натрия хлорида 0,9%. Тест-доза морским свинкам - 1,0 мл испытуемого раствора подкожно, мышам - 0,5 мл испытуемого раствора внутрибрюшинно.

Испытания готового продукта

Описание. Бесцветная прозрачная или слегка опалесцирующая жидкость с запахом фенола. Определение проводят органолептически.

Подлинность. Вакцина должна образовывать одну линию преципитации с сывороткой кроличьей против липополисахарида Shigella sonnei*. Определяют в реакции преципитации в геле по Оухтерлони.

Для постановки реакции пластиковую или стеклянную пластины размером 8,5 на 9,5 см заливают гелем агарозы по 12 мл на одну пластину. В застывшем слое геля с помощью пробойника и специального трафарета делают лунки: одну центральную, остальные - на периферии. Диаметр лунок 0,4 см, расстояние между ними должно быть 0,4 см. В центральную лунку вносят по 15 мкл раствора сыворотки кроличьей против ЛПС S. sonnei (титр 1:800), в периферические - 15 мкл испытуемой вакцины. Затем пластину помещают во влажную камеру на 24-48 часов. Вакцину считают подлинной, если с сывороткой кроличьей против ЛПС S. sonnei она дает одну линию преципитации.

Прозрачность. Прозрачная или опалесцирующая не более эталона 1 жидкость. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Прозрачность и степень мутности жидкостей".

Цветность. Бесцветная жидкость. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Степень окраски жидкостей".

Механические включения. Видимые механические включения должны отсутствовать. Определение проводят визуально в соответствии с ОФС "Видимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения и глазных лекарственных формах".

рН. От 6,7 до 7,3. Испытания проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС "Ионометрия".

Молекулярные параметры. Не менее 50% липополисахарида должно элюироваться в объеме до Kd=0,5. Определяют методом гель-фильтрации, используя сефарозу. Используют колонку длиной около 0,4 м, с внутренним диаметром 9 мм, уравновешенную 0,2 М раствором натрия хлорида. Через колонку пропускают около 0,9 мг лиофилизата субстанции в объеме 0,5 мл раствора 0,2 М натрия хлорида и элюируют при скорости около 14 мл/час. Элюирующиеся фракции регистрируют при помощи ультрафиолетового детектора при 206 нм. Выход липополисахарида оценивают по площади пиков до и после Кd = 0,5.

Калибровку колонки для определения полного и свободного объема колонки проводят с помощью калибровочного раствора, содержащего голубой декстран и натрия азид, в условиях, описанных выше.

Вычисление объема колонки , соответствующего Кd = 0,5, проводят по формуле:

,

где - свободный объем колонки, мл (объем элюции голубого декстрана), мл;

- общий объем колонки с гелем, мл (объем элюции натрия азида), мл;

0,5 - коэффициент распределения вещества на колонке.

Пересчитывают значение в мм и находят на хроматограмме:

Показатели	Значение в мл	Значение в мм
Общий объем колонки
Объем фракции

Пики, элюирующиеся до и после Kd = 0,5 (значение на хроматограмме, мм), интегрируют вручную.

Содержание липополисахарида в субстанции вакцины, элюировавшегося до Kd = 0,5, выраженное в процентах, определяют по формуле:

, где:

А - содержание липополисахарида в субстанции вакцины до Кd = 0,5,%;

- площадь пика, элюировавшегося до Кd = 0,5;

- суммарная площадь пиков, элюировавшихся до и после Кd = 0,5.

Примечания.

Раствор для калибровки хроматографической колонки. 1 мг натрия азида растворяют в 1 мл 0,2 М раствора натрия хлорида. Полученный 0,1% раствор натрия азида перемешивают на шейкере в течение 1 минуты.

0,5 мг голубого декстрана растворяют в 0,5 мл 0,2 М раствора натрия хлорида. Полученный раствор перемешивают на шейкере в течение 1 минуты. Добавляют в полученный раствор голубого декстрана 40 мкл 0,1% раствора натрия азида и быстро перемешивают на шейкере. Раствор для калибровки хроматографической колонки готовят непосредственно перед использованием.

0,2 М раствор натрия хлорида. В мерную колбу вместимостью 1 л помещают 500 мл воды очищенной, прибавляют 11,7 г натрия хлорида и доводят до метки водой очищенной. Полученный раствор перемешивают на магнитной мешалке в течение 5 минут. Хранят при температуре 4 - 8°С. Срок хранения - 1 мес.

Испытуемый раствор.  мг лиофилизата субстанции растворяют в 0,5 мл 0,2 М раствора натрия хлорида. Полученный раствор перемешивают на шейкере в течение 2 минут. Раствор готовят непосредственно перед использованием.

Извлекаемый объем. Не менее номинального. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Извлекаемый объем лекарственных форм для парентерального применения".

Стерильность. Вакцина должна быть стерильной. Испытания проводят методом прямого посева в соответствии с ОФС "Стерильность".

Пирогенность. Вакцина должна быть апирогенной. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Пирогенность". Препарат разводят апирогенным 0,9% раствором натрия хлорида так, чтобы 1 мл раствора содержал по 0,050 мкг и вводят кроликам из расчета 1 мл раствора вакцины (0,050 мкг) на 1 кг массы животного. После введения препарата температуру измеряют трижды с промежутком в один час.

Аномальная токсичность. Вакцина должна быть нетоксичной. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Аномальная токсичность", (Тест для вакцин и сывороток).

Морским свинкам препарат вводят подкожно, тест-доза - 1 мл, мышам - внутрибрюшинно, тест-доза - 0,5 мл. Наблюдение за животными осуществляется ежедневно в течение 7 суток.

Специфическая активность. Вакцина должна тормозить реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА) с сывороткой диагностической к шигеллам Зонне неадсорбированной в концентрации не более 6,25 мкг/мл, при отсутствии торможения с сывороткой диагностической к шигеллам Флекснера неадсорбированной в концентрации менее 25 мкг/мл. Оценивается в реакции торможении пассивной гемагглютинации (РТПГА).

Ингредиенты для проведения реакции РТПГА: сыворотки диагностические к шигеллам Зонне и Флекснера неадсорбированные, диагностикум эритроцитарный шигеллезный Зонне и Флекснера антигенный, испытуемая серия вакцины Шигеллвак, СО содержания липополисахарида.

Определение рабочего разведения шигеллезных диагностических сывороток.

Рабочее разведение определяют в реакции пассивной гемагглютинации. Для постановки реакции готовят двукратные разведения сывороток в 0,9% растворе натрия хлорида в объеме 100 мкл, начиная с разведения сывороток 1:10 в полистироловых круглодонных планшетах. В каждую из лунок прибавляют по 25 мкл соответствующего диагностикума. Планшеты встряхивают и оставляют на 1,5 - 2 ч при комнатной температуре (от 15 до 25°С).

Контролями являются:

1) проверка отсутствия спонтанной агглютинации диагностикума: в 2 лунки, содержащие по 50 мкл 0,9% раствора натрия хлорида, прибавляют по 25 мкл диагностикума;

2) проверка на отсутствие в испытуемой сыворотке агглютининов к эритроцитам барана: в 2 лунки планшета вносят по 50 мкл сыворотки в разведении 1:10 и прибавляют по 25 мкл 1% взвеси несенсибилизированных формалинизированных эритроцитов барана (контрольные эритроциты).

Учет реакции производится по четырехкрестной системе.

Титром антител испытуемой сыворотки считается последнее

разведение сыворотки, при котором наблюдается агглютинация эритроцитов интенсивностью не менее, чем на 3+ (+++ агглютинированы почти все эритроциты, на их фоне малозаметное кольцо из осевших неагглютинированных эритроцитов - "зонтик").

Рабочее разведение сыворотки для последующего использования в РТПГА берут на четыре разведения концентрированнее, чем диагносцируемый титр.

Для постановки реакции РТПГА готовят двукратные разведения СО содержания липополисахарида и серии вакцины Шигеллвак в 0,9% растворе натрия хлорида в объеме 50 мкл, начиная с 100 мкг/мл, в полистироловых планшетах. В каждую из лунок вносят 25 мкл сыворотки в рабочем разведении и прибавляют по 25 мкл диагностикума. Планшеты встряхивают и оставляют на 1,5-2 ч при комнатной температуре (от 15 до 25°С).

Учет результатов:

В гомологичной системе: минимальная концентрация ЛПС, тормозящая реакцию РПГА, должна быть не более 6,25 мкг/мл (дает ярко выраженный осадок неагглютинированных эритроцитов, который может быть оценен не менее чем на 3+).

В гетерологичной системе: отсутствие торможения в концентрации менее 25 мкг/мл.

Если полученные результаты не удовлетворяют этим условиям или вакцина обладает неспецифической активностью, контроль повторяют. Если и при повторном контроле обнаруживают те же результаты, серию вакцины бракуют.

Фенол. Не более 0,75 мг/доза. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Определение фенола спектрофотометрическим методом".

Маркировка и упаковка. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты (средства)".

Предупредительная надпись: "Для лечебно-профилактических и санитарно-профилактических учреждений".

Хранение. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты (средства)".

______________________________

* Приготовление сыворотки описано в частной фармакопейной статье.