Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья ОФС 42 "Определение белкового азота с реактивом Несслера с предварительным осаждением белкового материала"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Общая фармакопейная статья ОФС 42
"Определение белкового азота с реактивом Несслера с предварительным осаждением белкового материала"

Вводится взамен метода,
изложенного в ФС 42-3874-99

Данный метод предназначен для определения белкового азота в иммунобиологических лекарственных средствах (ИБЛС). Метод основан на свойстве реактива Несслера давать цветную реакцию с ионами аммония, образующимися после минерализации белковых продуктов. Для количественного определения содержания белкового азота используются колориметрические методы:

1. Метод с предварительным осаждением белковых компонентов с использованием кислоты трихлоруксусной рекомендуется для определения белкового азота в вирусных вакцинах, анатоксинах и инфекционных аллергенах.

2. Метод с предварительным осаждением белковых компонентов с использованием кислоты фосфорновольфрамовой рекомендуется для определения белкового азота в неинфекционных аллергенах.

1. Метод с использованием кислоты трихлоруксусной

Метод А. В центрифужную пробирку вместимостью 10 мл вносят необходимое количество испытуемого образца (А), согласно таблице N 1 прибавляют раствор кислоты трихлоруксусной до конечной концентрации 10% и перемешивают. Пробу оставляют на 18 - 20 ч при температуре 4 - 8°С. Осадок отделяют центрифугированием при 3000 g, при температуре 4 - 6°С в течение 30 мин. Осадок промывают 1 мл 10% раствором трихлоруксусной кислоты и вновь центрифугируют в аналогичных условиях. К осадку прибавляют 0,1 мл серной кислоты концентрированной. Пробирку закрывают стеклянным колпачком и минерализуют на песочной бане при температуре 190 - 210°С. Одновременно в аналогичных условиях минерализуют контрольную пробу, содержащую 0,1 мл кислоты серной концентрированной. Для ускорения минерализации используют водорода пероксид, который периодически добавляют в предварительно охлажденную пробирку по 1 - 2 капли. Минерализацию продолжают до обесцвечивания содержимого пробирки не менее 10 ч. К минерализату прибавляют 9,9 мл воды и перемешивают.

В химическую пробирку вносят необходимое количество минерализата (В) (таблица 1), содержащего 8 - 20 мкг азота, доводят объем раствора до 9,5 мл, перемешивают, прибавляют 0,5 мл реактива Несслера и вновь перемешивают.

Таблица 1 - Соотношение анализируемого образца, минерализата и реагента

Содержание белкового азота в анализируемом образце, мг/мл	Объем анализируемого образца (А), мл	Трихлоруксусная кислота		Объем минерализата (В), мл
		объем, мл	исходная концентрация,%
0,010-0,016	5	0,72	80	2,0
0,016-0,030	3	0,43	80	2,0
0,030-0,050	3	0,43	80	1,0
0,050-0,080	2	2,00	20	1,0
0,080-0,200	1	1,00	20	1,0
0,200-0,400	1	1,00	20	0,5

Измеряют оптическую плотность испытуемого и калибровочных растворов при 400 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм по сравнению с контрольным раствором, приготовленным аналогичным образом из контрольной пробы.

Одновременно с испытуемым образцом для подтверждения правильности методики проводят анализ стандартного образца (ОСО) "Содержание белкового азота". Анализ проводят при каждом определении.

Построение калибровочного графика. В химические пробирки вносят 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 мл стандартного раствора N 2, доводят объем растворов водой до 9,5 мл, перемешивают (содержание азота 5; 10; 15; 20; 25 мкг), прибавляют по 0,5 мл реактива Несслера и вновь перемешивают. Измеряют оптическую плотность как описано в методе А. Строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс количество мкг белкового азота, а по оси ординат - среднее значение оптической плотности.

Калибровочный график воспроизводят при каждом анализе.

Содержание белкового азота (Х) в мг/мл вычисляют по формуле:

, где

а - количество азота, рассчитанное по калибровочному графику, мкг;

А - количество анализируемого образца, мл;

В - количество минерализата, мл;

1000 - перевод мкг в мг;

10 - разведение минерализата.

Содержание белка по белковому азоту в мг/мл (Y), если нет других указаний в частных фармакопейных статьях, вычисляют по формуле:

, где

Х - содержание белкового азота, мг/мл;

6,25 - коэффициент пересчета азота на белок.

Содержание белкового азота, полученное по методу А, должно составлять от 0,01 до 0,4 мг/мл.

Примечания

Испытуемый раствор. 1, 2, 3 или 5 мл раствора испытуемого образца (согласно Таблице 1) (содержание белкового азота в анализируемой пробе должно быть 0,08 - 0,4 мг).

Основной стандартный раствор аммония сульфата 0,1 мг/мл (Раствор N 1). 0,2357 г аммония сульфата (х. ч.), доведенного до постоянной массы в эксикаторе над безводным кальция хлоридом, растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 500 мл и доводят объем раствора водой до метки. Основной раствор хранят при температуре 4 - 8°С в колбе с притертой пробкой в течение 1 года.

Стандартный раствор аммония сульфата 0,05 мг/мл (Раствор N 2). 50 мл раствора N 1 помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Раствор хранят при температуре 4 - 8°С в колбе с притертой пробкой в течение 3 мес.

Отраслевой стандартный образец (ОСО) "Содержание белкового азота".

Приготовление 80% раствора трихлоруксусной кислоты.

150 г трихлоруксусной кислоты растворяют в 100 мл воды. 1 мл раствора титруют 1 М раствором натрия гидроксида (индикатор-фенолфталеин).

Концентрацию трихлоруксусной кислоты (Х) в анализируемом растворе в процентах рассчитывают по формуле:

, где

а - количество 1 М раствора натрия гидроксида, пошедшее на титрование испытуемого образца, мл;

0,1634 - количество кислоты трихлоруксусной, соответствующее 1 мл 1 М раствора натрия гидроксида, г.

Концентрация трихлоруксусной кислоты должна быть 80 - 90%.

Раствор трихлоруксусной кислоты разводят до концентрации 80% и хранят в емкости из темного стекла в течение 6 месяцев (растворы трихлоруксусной кислоты меньших концентраций готовят соответствующим разведением 80% раствора). Перед каждым использованием раствора трихлоруксусной кислоты проводят проверочное определение процентной концентрации трихлоруксусной кислоты.

Метод В. В цетрифужную пробирку вносят 5 мл испытуемого образца, прибавляют 0,72 мл 80% раствора трихлоруксусной кислоты и перемешивают, если нет других указаний в частных фармакопейных статьях. Далее проводят минерализацию испытуемого образца по методу А. Объем минерализата доводят до 5 мл водой и перемешивают, отбирают в пробирку 1 мл полученного раствора, доводят объем водой до 9,5 мл, перемешивают, прибавляют 0,5 мл реактива Несслера и вновь перемешивают. Измеряют оптическую плотность испытуемого и калибровочных растворов при длине волны 400 нм в кюветах с толщиной слоя 20 мм по сравнению с контрольным раствором, приготовленным аналогичным образом из контрольной пробы.

Содержание белкового азота (Х) в мг/мл вычисляют по формуле:

, где

а - количество азота, рассчитанное по калибровочному графику, мкг;

- разведение минерализата, мл;

- количество препарата, взятое на минерализацию, мл;

1 - количество минерализата, взятое на колориметрирование, мл;

1000 - перевод в миллиграммы.

Построение калибровочного графика. В химические пробирки вносят 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 мл стандартного раствора N 3 (содержание азота 2; 4; 6; 8; 10; 12 мкг), доводят объем раствора водой до 9,5 мл, перемешивают, прибавляют по 0,5 мл реактива Несслера и вновь перемешивают. Измеряют оптическую плотность растворов, как указано выше. Строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс количество мкг белкового азота, а по оси ординат - среднее значение оптической плотности.

Калибровочный график воспроизводят при каждом анализе.

Содержание белкового азота, полученное по методу В должно составлять от 2,5 до 10 мкг/мл.

Примечания

Основной стандартный раствор аммония сульфата 0,1 мг/мл (Раствор N 1. Приготовление основного стандартного раствора аммония сульфата указано в методе А.

Стандартный раствор аммония сульфата 0,02 мг/мл (Раствор N 3). 20 мл раствора N 1 помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор хранят при температуре 4 -8 °С в колбе с притертой пробкой в течение 3 мес.

Приготовление 80% раствора трихлоруксусной кислоты проводят по методике описанной в методе А.

2. Метод определения белкового азота с использованием кислоты фосфорновольфрамовой

Определение проводят по ОФС "Определение белка" (метод Б с использованием фосфорновольфрамовой кислоты).

Содержание белкового азота в неинфекционных аллергенах должно быть от 0,01 до 0,4 мг/мл.

Построение калибровочного графика аналогично, описанному в методе А.

Одновременно с испытуемым образцом для подтверждения правильности методики проводят анализ стандартного образца (ОСО) "Содержание белкового азота в неинфекционных аллергенах". Анализ проводят при каждом анализе.

Примечание

Отраслевой стандартный образец (ОСО) "Содержание белкового азота в неинфекционных аллергенах".