Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья ОФС 42 "Общие принципы анализа цитокинов и интерферонов методом обращённофазной ВЭЖХ"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Общая фармакопейная статья ОФС 42
"Общие принципы анализа цитокинов и интерферонов методом обращённофазной ВЭЖХ"

Вводится впервые

Данная общая фармакопейная статья распространяется на анализ цитокинов и интерферонов методом обращеннофазной ВЭЖХ (ОФ ВЭЖХ). Метод ОФ ВЭЖХ используется для оценки подлинности, содержания действующего вещества, специфических и неспецифических примесей группы цитокинов и интерферонов, а также ряда вспомогательных веществ, входящих в состав данной группы иммунобиологических лекарственных средств (ИБЛС).

Метод обращеннофазной ВЭЖХ

Принцип метода ОФ ВЭЖХ основан на распределении компонентов смеси между полярным элюэнтом и неполярными группами алкидных цепочек на поверхности сорбента. Поведение молекул пептидов и белков в условиях ОФ ВЭЖХ находится в зависимости удерживания сорбентом от незначительных изменений концентрации органического растворителя в подвижной фазе. В условиях ОФ ВЭЖХ для цитокинов и интерферонов характерно наличие нескольких точек связывания с сорбентом, вследствие чего переход от прочной, почти полной сорбции вещества в неподвижной фазе к его преимущественному нахождению в подвижной фазе может быть очень резким. Постепенное увеличение силы элюента (например, концентрации органического растворителя) может

длительное время оставаться без видимого эффекта, затем, при достижении критического значения элюирования, происходит быстрое перераспределение вещества в пользу подвижной фазы. В связи с этим, анализ цитокинов и интерферонов методом ОФ ВЭЖХ проводят в условиях градиентного элюирования, в процессе которого для каждого белка создаются условия быстрой десорбции.

Градиентное элюирование

Величина среднего фактора ёмкости (k), характеризующего удерживание сорбента в условиях градиентного элюирования, прямо пропорциональна продолжительности градиента и обратно пропорциональна разнице в содержании органического растворителя в начальной и конечной точках градиента. Для получения удовлетворительных значений k  для молекул белков цитокинов и интерферонов необходимо использовать разделение с продолжительным временем градиента и, по возможности, с меньшей разницей в содержании органического растворителя в начальной и конечной точках градиента.

Как правило, продолжительность градиента в большинстве методик анализа цитокинов и интерферонов не превышает 60 минут.

Другим важным параметром является крутизна градиента - изменение процентного содержания ацетонитрила в подвижной фазе в единицу времени. В связи с тем, что в препаратах цитокинов и интерферонов наряду с основным действующим веществом содержатся, как правило, близкородственные примеси и в связи с этим, необходимо задавать достаточно пологую форму градиента , которая позволяет обеспечить достаточное разрешение пиков для определения чистоты препарата.

Выбор подвижной фазы. В обращённофазной хроматографии подвижная фаза состоит из буферного раствора и органического растворителя. При разделении белков и пептидов в состав растворов подвижной фазы как правило, входят разбавленные растворы кислот таких как: буфер фосфорная, трифторуксусная, муравьиная, уксусная или гептафтормасляная.

В качестве органического компонента подвижной фазы при анализе белков и пептидов методом ОФ ВЭЖХ наиболее часто используется ацетонитрил, обладающий низкой вязкостью и низким поглощением в УФ диапазоне с высоким разрешением и получением узких пиков правильной формы. Помимо ацетонитрила, в состав подвижной фазы могут входить ацетонитрил, метанол, пропанол и изопропанол. Детектирование пептидов и белков проводится по УФ-поглощению пептидной связи в диапазоне от 205 до 220 нм.

Выбор колонки. Наиболее часто для анализа пептидов и белков используются колонки, с сорбентами на основе силикагеля с привитыми лигандами в виде прямоцепочечных алкильных групп (, , и размером частиц не более 5 микрон), которые находятся в прямо пропорциональной зависимости, от увеличения длины алкильной цепи увеличивается время удерживания пиков.

Температура колонки. При испытании показателя подлинности лекарственных средств для получения воспроизводимых результатов времени удерживания анализируемых компонентов, необходимо обеспечение термостатирования колонки с точностью °C.

Анализ вспомогательных веществ

Метод ОФ ВЭЖХ используется также для определения содержания в препаратах цитокинов и интерферонов таких вспомогательных веществ как маннитол, бензиловый спирт, м-крезол, полисорбат-80 и метионин.

Все вышеперечисленные вещества, за исключением метионина, анализируются в изократических условиях. Для анализа метионина используют режим градиентного элюирования.

Для анализа всех веществ, за исключением маннитола, используются колонки, заполненные обращённофазными сорбентами или с размером частиц 5 мкм и порами размером 60 - 120 А. Для определения маннитола используют колонку, заполненную силикагелем, к поверхности которого привиты лиганды, содержащие аминогруппы.

В качестве подвижной фазы используют смеси ацетонитрил (метанол) - вода с различной концентрацией ацетонитрила или метанола (маннитол, полисорбат-80, м-крезол). Для определения спирта бензилового используют смеси ацетонитрил (метанол) - ацетатный буфер (рН 5,6).

Полисорбат-80 определяют как по количеству образовавшейся в процессе щелочного гидролиза кислоты олеиновой, так и без дополнительной обработки лекарственного средства по суммированным пикам.

Для детектирования всех вспомогательных веществ, за исключением маннитола, используют УФ-детектор. При определении маннитола используют рефрактометрический детектор.

Условия проведения анализа (пробоподготовка, тип колонки, состав подвижной фазы, вид элюирования, способ детектирования, учёт и интерпретация результатов) должны быть изложены в частных фармакопейных статьях.