Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья ОФС 42- "Определение анти-А и анти-В гемагглютининов в препаратах иммуноглобулинов человека"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Общая фармакопейная статья ОФС 42-
"Определение анти-А и анти-В гемагглютининов в препаратах иммуноглобулинов человека"

Настоящая фармакопейная статья определяет анти-А и анти-В гемагглютинины в препаратах иммуноглобулинов человека методом непрямой гемагглютинации "на плоскости" (метод А) или гелевым методом (метод В).

Содержание гемагглютининов - антител против антигенов А и В эритроцитов в иммуноглобулине человека при внутривенном и подкожном введении является одной из причин побочного действия. При инфузионном введении больших объемов, присутствие повышенного количества гемагглютинов анти-А и анти-В, может привести к интраваскулярному гемолизу с резким снижением гемоглобина, гематокрита, ретикулоцитозом, гипербилирубинемией, гемоглобинурией и др. симптомами, что наиболее часто встречается в педиатрической практике при лечении новорожденных или у пациентов с нарушениями иммунной системы.

Для исключения подобных осложнений иммуноглобулинотерапии в иммуноглобулинах человека для внутривенного и подкожного введения нормируется содержание гемагглютининов анти-А и анти-В.

Содержащиеся в испытуемом препарате анти-А и анти-В гемагглютинины, являясь неполными антителами класса Ig G, вызывают сенсибилизацию эритроцитов. Добавление антиглобулиновой сыворотки в солевой среде при температуре °С вызывает агглютинацию сенсибилизированных эритроцитов и визуализирует результат реакции.

Содержание гемагглютининов определяют с использованием эритроцитов человека групп крови: А (II) резус-отрицательный и В (III) резус-отрицательный. Допустимо применение как свежеприготовленной суспензии (при использовании метода непрямой гемагглютинации "на плоскости" (метод А), так и стандартных эритроцитов, входящих в наборы для определения групп крови (при использовании обоих методов).

При определении содержания гемагглютининов "на плоскости" (метод А) используют 5% суспензию эритроцитов, при определении содержания гемагглютининов гелевым методом (метод В) использую 0,8% суспензию эритроцитов.

Проведение анализа

Метод А

В стеклянные пробирки или лунки планшета вносят равное количество соответствующего разведения препарата и 5% суспензии эритроцитов человека группы крови А (II) (первый ряд) и 5% суспензии эритроцитов человека группы крови В (III) (второй ряд). К подготовленному разведению стандартных образцов содержания анти-А и анти-В гемагглютининов (положительного и отрицательного) также добавляют равное количество 5% суспензии эритроцитов человека группы крови А (II) (первый ряд) и 5% суспензии эритроцитов человека группы крови В (III) (второй ряд). Пробы осторожно перемешивают и инкубируют в течение 30 мин при температуре °С. По окончании инкубации пробы центрифугируют при 1500 - 2000 об/мин в течение 10 мин. Затем удаляют надосадочную жидкость, полученный осадок ресуспендируют в десятикратном объеме 0,9% раствора натрия хлорида и вновь центрифугируют при 1500 - 2000 об/мин в течение 10 мин. Процедуру повторяют не менее 3 раз. Надосадочную жидкость удаляют, добавляют равный (осадку эритроцитов) объем поливалентной антиглобулиновой сыворотки (сыворотка Кумбса) и осторожно перемешивают. Пробы инкубируют при температуре °С в течение 30 мин. По окончании инкубации под микроскопом или визуально исследуют пробы, отмечая наличие агглютинации.

Титр гемагглютининов определяют как максимальное разведение испытуемого образца, при котором происходит агглютинация эритроцитов любой степени интенсивности. Разведение до содержания белка 30 г/л при определении титра не учитывают.

В каждую пробу, в которой не определяется агглютинация, вносят равное количество (по объему) контрольных клеток Кумбса, осторожно перемешивают и через 2 - 4 мин оценивают агглютинацию.

Критерии приемлемости результатов

- Содержание гемагглютининов в стандартных образцах должно соответствовать аттестованным величинам.

- В пробах с отрицательным результатом (отсутствие агглютинации) после добавления контрольных клеток Кумбса должна наблюдаться агглютинация.

Метод В

Гелевый метод основан на использовании гелевой карты, представляющей собой пластиковый планшет с микропробирками, наполненными гелевыми колонками. Каждая микропробирка состоит из дозирующей/инкубационной камеры и колонки, содержащей полимеризованные микросферы декстрана в буферном растворе низкой ионной силы (LISS), смешанном с поливалентной антиглобулиновой сывороткой (сыворотка Кумбса).

В дозирующую/инкубационную камеру микропробирки вносят по 1 капле 0,8% суспензии стандартных эритроцитов человека группы крови А (II) (первый ряд) и 0,8% суспензии эритроцитов человека группы крови В (III) (второй ряд) и по 25,0 мкл соответствующего разведения испытуемого образца. Одновременно готовят пробы положительного и отрицательного стандартных образцов содержания анти-А и анти-В гемагглютининов: в дозирующую/инкубационную камеру микропробирки вносят по 1 капле 0,8% суспензии стандартных эритроцитов человека группы крови А (II) (первый ряд) и 0,8% суспензии эритроцитов человека группы крови В (III) (второй ряд) и по 25,0 мкл соответствующего разведения стандартного образца. Пробы инкубируют при температуре °С в течение 15 мин. По окончании инкубации пробы центрифугируют на специализированной центрифуге (для гелевых карт) в стандартных условиях (запрограмированный режим) и оценивают агглютинацию.

Титр гемагглютининов определяют как максимальное разведение испытуемого образца, при котором наблюдают распределение агглютинированных эритроцитов в толще гелевой колонки или в её верхней части. Неагглютинированные эритроциты оседают на дно микропробирки. Разведение до содержания белка 30 г/л при определении титра не учитывают.

Критерии приемлемости результатов

- Содержание гемагглютининов в стандартных образцах должно соответствовать аттестованным величинам.

Примечание:

1) Подготовка испытуемого образца

Испытуемый препарат разводят солевым раствором (раствор натрия хлорида 0,9% или буферный раствор низкой ионной силы LISS) до содержания белка 30 г/л.

Готовят два ряда двукратных разведений испытуемого образца с использованием 1% раствора бычьего сывороточного альбумина (1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128). При использовании гелевого метода (метод В) разведения препарата готовят с использованием раствора натрия хлорида 0,9% или буферного раствора низкой ионной силы LISS.

2) Подготовка стандартных образцов содержания анти-А и анти-В гемагглютининов

В качестве стандарных образцов используют 5% раствор иммуноглобулина человека с нормируемым содержанием анти-А и анти-В гемагглютининов (положительный стандартный образец) и 5% раствор иммуноглобулина человека, содержащий анти-А и анти-В гемагглютинины в разведении менее 1:2 (отрицательный стандартный образец). Подготовку стандартных образцов проводят в соответствии с инструкцией по применению.

3) Подготовка суспензии стандартных эритроцитов.

Для приготовления 5% суспензии эритроциты человека группы крови А (II), резус-отрицательные, свежеприготовленные эритроциты не более 3 сут хранения, центрифугируют 10 мин при 1500 - 2000 об/мин при комнатной температуре, надосадочную жидкость сливают. Полученный осадок ресуспендируют в десятикратном объеме 0,9% раствора натрия хлорида и центрифугируют в течение 10 мин при 1500 - 2000 об/мин при комнатной температуре. Процедуру повторяют не менее 3 раз до получения прозрачной надосадочной жидкости. Для получения 5% суспензии 1 объем осадка эритроцитов ресуспендируют в 19 объемах 0,9% раствора натрия хлорида.

Аналогичным образом приготавляют 5% суспензию эритроцитов человека группы крови В (III), резус-отрицательные.