Государственный стандарт качества лекарственного средства. Фармакопейная статья ФС 42 "Сыворотка противогангренозная поливалентная лошадиная"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Фармакопейная статья ФС 42
"Сыворотка противогангренозная поливалентная лошадиная"

Вводится впервые

Сыворотка противогангренозная поливалентная лошадиная, которая представляет собой иммуноглобулиновую фракцию сыворотки крови лошадей, содержащую специфические антитела, нейтрализующие токсины возбудителей газовой гангрены рода Clostridium (C. perfringens type A, C. oedematiens, type A, C. septicum).

Cыворотка противогангренозная поливалентная лошадиная предназначена для профилактики и лечения газовой гангрены.

Производство

Сыворотку получают из плазмы крови лошадей, иммунизированных гангренозными токсинами/анатоксинами. Для получения очищенной концентрированной иммуноглобулиновой фракции плазмы крови лошади, содержащей антитела, нейтрализующие гангренозные токсины, применяют методы солевого фракционирования, ферментолиза, хроматографии, мембранной фильтрации.

Испытание готового продукта

Описание. Прозрачная или слегка опалесцирующая, бесцветная или с желтоватым оттенком жидкость без осадка. Определение проводят визуально.

Подлинность. Должна нейтрализовывать действие токсинов, продуцируемых C. perfringens type A, C. oedematiens type A, C. septicum. Определение проводят по разделу "Специфическая активность".

Прозрачность. Прозрачная или слегка опалесцирующая жидкость Показатель оптической плотности не должен превышать 0,05. Определение проводят в соответствии с ОФС "Прозрачность и степень мутности жидкостей", если нет других указаний в частной фармакопейной статье. Определение проводят спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм в кювете толщиной слоя 1 см.

Цветность. Бесцветная или с желтоватым оттенком жидкость. Показатель оптической плотности не должен превышать 0,15. Определение проводят в соответствии с ОФС "Степень окраски жидкостей", если нет других указаний в частной фармакопейной статье. Определение проводят при длине волны 400 нм в кювете толщиной слоя 1 см.

Механические включения. Видимые механические включения должны отсутствовать. Определение проводят в соответствии с ОФС "Видимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения и глазных лекарственных формах".

рН. От 6,8 до 7,2, если нет других указаний в частной фармакопейной статье. Определение проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС "Ионометрия".

Содержание белка. От 8 до 12%, если нет других указаний в частной фармакопейной статье. Определение проводят колориметрическим методом с биуретовым реактивом в соответствии с ОФС "Определение белка".

Стерильность. Должна быть стерильной. Испытания проводят методами прямого посева или мембранной фильтрации в соответствии с ОФС "Стерильность", если нет других указаний в частной фармакопейной статье.

Пирогенность. Должна быть апирогенной. Определение проводят в соответствии с ОФС "Пирогенность", если нет других указаний в частной фармакопейной статье. Указывают допустимые пределы изменений температуры у животных, тест-дозу. Если не указано иначе, вводят 1 мл неразведенной сыворотки на 1 кг массы кролика.

Аномальная токсичность. Должна быть нетоксичной. Определение проводят в соответствии с ОФС "Аномальная токсичность". Пяти белым мышам препарат вводят по 1 мл внутрибрюшинно, двум морским свинкам вводят по 10 мл подкожно.

Специфическая активность. Не менее 700 Международных единиц (МЕ) каждого типа антитоксинов в 1 мл. Специфическую активность сыворотки по каждому типу антитоксинов определяют в тесте нейтрализации соответствующих токсинов.

Определение опытных доз гангренозных токсинов (L+/).

Опытная доза токсина (L+/) представляет собой наименьшее количество токсина, которое в смеси с определенным количеством соответствующего антитоксина при внутривенном введении белым мышам вызывает гибель не менее 50% мышей.

Опытную дозу токсина C. perfringens определяют по отношению к 0,1 МЕ антитоксина perfringens, C. septicum по отношению к 0,2 МЕ антитоксина septicum, C. oedematiens по отношению к 0,02 МЕ антитоксина oedematiens.

Для определения опытных доз токсинов к 0,1 МЕ стандартного образца активности антитоксина perfringens, или 0,2 МЕ стандартного образца активности антитоксина septicum, или 0,02 МЕ стандартного образца активности антитоксина oedematiens, взятых в объеме 0,2 мл, добавляют различные дозы соответствующих токсинов в объеме 0,3 мл.

Полученные смеси перемешивают и выдерживают при температуре °С в течение мин, затем каждую вводят по 0,5 мл внутривенно 4 белым мышам.

Смеси готовят из расчета на 5 мышей (1 мл стандартного образца активности антитоксина + 1,5 мл токсина). При определении опытной дозы токсинов C. perfringens и C. septicum наблюдают за животными в течение 48 ч, а опытной дозы токсина C. oedematiens - в течение 96 ч, отмечая количество выживших мышей в каждой группе.

Определение титра антитоксина perfringens

Готовят ряд разведений испытуемой поливалентной противогангренозной сыворотки на 0,9% растворе натрия хлорида с таким расчетом, чтобы, в зависимости от предполагаемого титра, 0,1 МЕ содержалась в 0,2 мл раствора. К 1 мл каждого разведения сыворотки добавляют 1,5 мл токсина C. perfringens, содержащего в объеме 0,3 мл опытную дозу. Определение проводят с 6-8 разведениями сыворотки (1:1300; 1:1400; 1:1500 и т.д.), отличающимися по своей предполагаемой активности одно от другого на 10-20%.

Каждый опыт титрования сопровождают контролем опытной дозы токсина, вводимой в смеси с 0,1 МЕ стандартного образца активности антитоксина perfringens. После выдерживания при температуре °С в течение мин каждую смесь вводят 4 белым мышам внутривенно в объеме 0,5 мл. За животными наблюдают в течение 48 ч. К концу наблюдения в контроле должно погибнуть не менее 50% взятых в опыт мышей. Максимальное разведение сыворотки, предохраняющее от гибели 50% взятых в опыт белых мышей, содержит 0,1 МЕ в 0,2 мл, т.е. 0,5 МЕ в 1 мл. Истинный титр антитоксина perfringens в испытуемой сыворотке рассчитывают, исходя из взятых в опыт разведений. Например, если сыворотка защищает от гибели 50% мышей в разведении 1:1300, то 1 мл этого разведения содержит 0,5 МЕ антитоксина perfringens, следовательно, 1 мл испытуемой сыворотки содержит 0,5 МЕ х 1300 = 650 МЕ антитоксина perfringens.

Определение титра, антитоксина septicum

Готовят ряд разведений испытуемой поливалентной противогангренозной сыворотки в 0,9% растворе натрия хлорида с таким расчетом, чтобы, в зависимости от предполагаемого титра, в 0,2 мл разведенной сыворотки содержалось 0,2 МЕ. К I мл каждого разведения сыворотки добавляют 1,5 мл токсина C. septicum, содержащего в объеме 0,3 мл опытную дозу. Определение проводят с 6-8 разведениями сыворотки (1:650; 1:700; 1:750 и т.д.), отличающимися по своей предполагаемой активности одно от другого на 10-20%.

Каждый опыт титрования сопровождают контролем опытной дозы токсина, вводимой в смеси с 0,2 МЕ стандартного образца активности антитоксина septicum. После выдерживания при температуре °С в течение мин смесь с каждым разведением сыворотки вводят 4 белым мышам внутривенно в объеме 0,5 мл. За животными наблюдают в течение 48 ч. К концу наблюдения в контроле должно погибнуть не менее 50% взятых в опыт мышей. Максимальное разведение сыворотки, предохраняющее от гибели 50% взятых в опыт белых мышей, содержит 0,2 МЕ в 0,2 мл, т.е. 1 МЕ в 1 мл. Истинный титр антитоксина septicum в испытуемой сыворотке рассчитывают, исходя из взятых в опыт разведений. Например, если сыворотка защищает от гибели 50% мышей в разведении 1:700, то 1 мл этого разведения содержит 1 МЕ, следовательно, 1 мл неразведенной сыворотки содержит 1 МЕ х 700 = 700 МЕ антитоксина septicum.

Определение титра антитоксина oedematiens

Готовят ряд разведений испытуемой поливалентной противогангренозной сыворотки в 0,9% растворе хлорида натрия с таким расчетом, чтобы, в зависимости от предполагаемого титра, 0,02 МЕ содержались в 0,2 мл раствора. К 1 мл каждого разведения сыворотки добавляют 1,5 мл токсина, содержащего в объеме 0,3 мл опытную дозу. Определение проводят с 6-8 разведениями сыворотки (3:6500; 1:7000; 1:7500 и т.д.), отличающимися по предполагаемой активности одно от другого на 10-20%. Каждый опыт титрования сопровождают контролем опытной дозы токсина, вводимой в смеси с 0,02 МЕ стандартного образца активности антитоксина oedematiens. После выдерживания при температуре °С в течение мин каждую смесь вводят 4 белым мышам внутривенно в объеме 0,5 мл. За животными наблюдают в течение 96 ч. К концу наблюдения в контроле должно погибнуть не менее 50% взятых в опыт мышей.

Максимальное разведение сыворотки, предохраняющее от гибели 50% взятых в опыт белых мышей, содержит 0,02 МЕ в 0,2 мл, т.е. 0,1 МЕ в 1 мл. Истинный титр антитоксина oedematiens в испытуемой сыворотке рассчитывают, исходя из взятых в опыт разведений. Например, если сыворотка защищает от гибели 50% мышей в разведении 1:8000, то в 1 мл этого разведения содержится 0,1 МЕ антитоксина oedematiens, следовательно, 1 мл неразделенной сыворотки содержит 0,1 МЕ х 8000 = 800 МЕ антитоксина oedematiens.

Активность каждого компонента поливалентной сыворотки рассчитывают, исходя из разведения с наименьшей концентрацией сыворотки, которое в смеси с опытной дозой токсина обеспечивает 100% выживаемость взятых в опыт животных.

Специфическую активность (титр) поливалентной сыворотки выражают по компоненту с наименьшей активностью. В данном примере - по антитоксину perfringens.

Удельная активность.Не менее 500 МЕ на 0,1 г белка каждого типа антитоксина C. perfringens, C. oedematiens, C. septicum.

Определяют по формуле:

,

Где Т - титр сыворотки, МЕ/мл

С - концентрация белка, г/мл

Сульфат-ионы. Не более 0,025%. Определение проводят колориметрическим методом.

Методика

К 1 мл испытуемого образца прибавляют 3,5 мл воды, 0,5 мл 5% раствора бария хлорида и перемешивают. Выдерживают 15 мин. Измеряют оптическую плотность суспензии при длине волны 540 нм в кювете с толщиной слоя 5 мм по сравнению с контрольным раствором, содержащим 1 мл испытуемого образца и 4 мл воды.

Расчет содержания сульфат-ионов проводят по калибровочному графику. Калибровочный график строят при каждом анализе.

Построение калибровочного графика

Готовят основной раствор калия сульфата. К 0,5 - 4,5 мл полученных с интервалом 0,5 мл растворов прибавляют воду до объема 4,5 мл (за исключением последнего разведения) и 0,5 мл 5% раствора бария хлорида, перемешивают. Полученные растворы содержат сульфат-ионы в концентрации от 10 до 90 мкг/мл. Проводят анализ, как указано выше. Строят график зависимости оптической плотности от концентрации сульфат-ионов (мкг/мл).

Примечание:

Приготовление основного раствора калия сульфата, содержащего 1 мг/мл сульфат-ионов: 1,8140 г калия сульфата, высушенного до постоянной массы при температуре 100-105 °C, растворяют в воде в мерной колбе, вместимостью 1 л, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

Приготовление рабочего раствора калия сульфата 0,1 мг/мл сульфат-ионов. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 10 мл точно отмеренного основного раствора калия сульфата, доводят объем водой до метки и перемешивают.

Натрия хлорид

От 0,85 до 0,95%. Определение проводят в соответствии с ОФС "Определение хлоридов методом осадительного титрования".

Хлороформ

Не более 0,1%. Определение проводят колориметрическим методом, основанным на способности хлороформа образовывать с резорцином в щелочной среде соединение хиноидной структуры, которое дает цветную реакцию.

Методика

В пробирки вносят по 0,1 мл препарата, добавляют 0,9 мл 0,9% раствора натрия хлорида, 2 мл 20% раствора натрия гидроксида и 1 мл 10% раствора резорцина.

Параллельно с испытуемыми образцами препарата готовят аналогичную пробу с образцом сравнения - 0,1% раствором хлороформа.

Содержимое пробирок перемешивают и нагревают на кипящей водяной бане в течение 1 мин. Пробы осторожно охлаждают в холодной воде до температуры 15-18°С, затем измеряют оптическую плотность (Д) окрашенного раствора при длине волны 540 нм в кювете с толщиной слоя 5 мм по сравнению с контрольным раствором, состоящим из 1 мл воды и 2 мл 20% раствора натрия гидроксида. Раствор резорцина в контрольный раствор не добавляют, т.к. продукты его окисления окрашиваются в зеленый цвет.

Расчет содержания хлороформа проводят путем сравнения оптической плотности испытуемого образца и образца сравнения - 0,1% раствора хлороформа.

Содержание хлороформа в испытуемом образце (в%) вычисляют по формуле:

, где

- оптическая плотность испытуемого образца,

- оптическая плотность образца сравнения - 0,1% раствора хлороформа.

0,1 - количество испытуемого образца, взятого на анализ, мл

Примечание: Приготовление 0,1% раствора хлороформа:

Хлороформ 0,1 мл

Вода до 100 мл

Раствор используют свежеприготовленным

Приготовление 10% раствора резорцина:

Резорцин 5 г;

Вода до 50 мл

Раствор используют свежеприготовленным

Извлекаемый объем

Не менее номинального. Определение проводят в соответствии с ОФС "Инъекционные лекарственные формы".

Растворители и реагенты, выпускаемые в комплекте с лекарственным средством

В комплекте с сывороткой противогангренозной поливалентной лошадиной выпускается сыворотка лошадиная, разведенная 1:100, предназначенная для постановки внутрикожной пробы с целью выявления чувствительности человека к лекарственному средству, если это предусмотрено инструкцией по применению.

Упаковка и маркировка

В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты (средства).

Транспортирование, хранение.

Температура транспортирования и хранения должна находиться в пределах от 2 до 8°С, если в частной фармакопейной статье нет других указаний.