Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья ОФС 42- "Определение анти-D антитела в иммуноглобулине человека для внутривенного введения"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Общая фармакопейная статья ОФС 42-
"Определение анти-D антитела в иммуноглобулине человека для внутривенного введения"

Настоящая фармакопейная статья определяет содержание анти-D антител в иммуноглобулине человека при внутривенном введении.

Анти-D антитела определяют методом гемагглютинации на основе прямого теста Кумбса "на плоскости" (метод А) или в геле (метод В). Содержащиеся в испытуемом препарате анти-D антитела, являясь иммуноглобулинами класса G - гемагглютининами, вызывают агглютинацию D-положительных эритроцитов.

Одной из причин побочного действия препаратов иммуноглобулина человека при внутривенном введении является содержание анти-D антител. Инфузии больших объемов этих препаратов, содержащих анти-D антитела выше допустимого уровня, резус-положительным пациентам могут приводить к интраваскулярному гемолизу с резким снижением гемоглобина, гематокрита, ретикулоцитозом, гипербилирубинемией, гемоглобинурией и др. симптомами.

Подготовка испытуемого образца

Препарат разводят фосфатным буферным раствором рН , содержащим 2 г/л бычий сывороточный альбумин, до содержания белка 25 г/л.

Готовят два ряда двукратных разведений препарата с использованием фосфатного буферного раствора рН , содержащего 2 г/л бычий сывороточный альбумин (1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256). При использовании гелевого метода (метод В) разведения препарата готовят с использованием раствора натрия хлорида 0,9% или буферного раствора низкой ионной силы LISS.

Подготовка стандартных образцов содержания анти-D антител

В качестве стандарных образцов используют 5% раствор иммуноглобулина человека, содержащий 0,0475 МЕ/мл анти-D антител и имеющий номинальный титр в реакции гемагглютинации 1:8 (положительный стандартный образец) и 5% раствор иммуноглобулина человека, содержащий анти-D антитела в разведении не более 1:2 (отрицательный стандартный образец). Содержание анти-D антител в положительном стандартном образце является максимально допустимым для препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения. Подготовку стандартных образцов проводят в соответствии с инструкцией по применению. Анализ проводят с образцами, разведенными фосфатным буферным раствором рН , содержащим 2 г/л бычий сывороточный альбумин, до содержания белка 25 г/л.

Подготовка суспензии стандартных эритроцитов.

Содержание анти-D антител определяют с использованием папаинизированных D-положительных эритроцитов человека группы крови 0. Предпочтительно использование эритроцитов фенотипа , возможно также применение эритроцитов фенотипов или . Смешивание эритроцитов разных фенотипов недопустимо.

Для контроля специфичности анализа применяют D-отрицательные эритроциты фенотипа 0rr.

При проведении испытания возможно использование свежеприготовленной суспензии эритроцитов при испытаниях методом гемагглютинации на основе прямого теста Кумбса "на плоскости" (метод А) или стандартных эритроцитов, входящих в тест-наборы (при использовании обоих методов). При определении содержания анти-D-антител методом А используют 3% суспензию эритроцитов, при определении содержания гемагглютининов гелевым методом (метод В) используют 0,8% суспензию эритроцитов.

Свежеприготовленные не более 3-х дней хранения D-положительные эритроциты, полученные не менее чем от 3 доноров, центрифугируют в течение 10 мин при 1500 - 2000 об/мин, надосадочную жидкость сливают. Осадок ресуспендируют в десятикратном объеме фосфатного буферного раствора рН и центрифугируют 10 мин при 1500 - 2000 об/мин. Процедуру повторяют не менее 3 раз, до получения прозрачной надосадочной жидкости.

В стеклянную пробирку вносят равные объемы промытых эритроцитов и раствора папаина, инкубируют в течение 15 мин при температуре °С. Затем суспензию центрифугируют при 1500 - 2000 об/мин в течение 10 мин. Удаляют надосадочную жидкость, осадок ресуспендируют в десятикратном объеме фосфатного буферного раствора рН и центрифугируют 10 мин при 1500 - 2000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют. Для приготовления 3% суспензии 1 объем осадка папаинизированных эритроцитов ресуспендируют в 32 объемах фосфатного буферного раствора рН , содержащего 2 г/л бычего сывороточного альбумина.

Аналогичным образом приготавляют 3% суспензию D-отрицательных эритроцитов, полученных от 1 - 3 доноров.

Проведение анализа

Метод А

В стеклянные пробирки или лунки планшета вносят равное количество соответствующего разведения препарата и 3% суспензии D-положительных эритроцитов человека группы крови 0 (первый ряд) и 3% суспензии D-отрицательных эритроцитов человека группы крови 0 (второй ряд). К подготовленному разведению стандартного образца также добавляют равное количество 3% суспензии D-положительных эритроцитов человека группы крови 0 (первый ряд) и 3% суспензии D-отрицательных эритроцитов человека группы крови 0 (второй ряд). Пробы осторожно встряхивают (на шейкере) в течение 10 с, затем центрифугируют в течение 1 мин при 80 об/мин. Пробирки (планшеты) располагают под уголом 70° и оценивают визуально агглютинацию через 4 - 5 мин (но не более чем через 10 мин).

Титр анти-D антител определяют как максимальное разведение препарата, при котором наблюдают агглютинацию любой интенсивности. Разведение до содержания белка 25 г/л при определении титра не учитывают.

Метод В

Гелевый метод основан на использовании гелевой карты, представляющей собой пластиковый планшет с микропробирками, наполненными гелевыми колонками. Каждая микропробирка состоит из дозирующей/инкубационной камеры и колонки, содержащей полимеризованные микросферы декстрана в буферном растворе низкой ионной силы (LISS).

В дозирующую/инкубационную камеру микропробирки вносят по 1 капле 0,8% суспензии стандартных D-положительных эритроцитов человека группы крови 0 (первый ряд) или по 1 капле 0,8% суспензии стандартных D-отрицательных эритроцитов человека группы крови 0 (второй ряд) и по 25,0 мкл соответствующего разведения препарата. Одновременно готовят пробы положительного и отрицательного стандартных образцов содержания анти-D антител: в дозирующую/инкубационную камеру микропробирки вносят по 1 капле 0,8% суспензии стандартных D-положительных эритроцитов человека группы крови 0 (первый ряд) или по 1 капле 0,8% суспензии стандартных D-отрицательных эритроцитов человека группы крови 0 (второй ряд) и по 25,0 мкл соответствующего разведения стандартного образца. Пробы инкубируют при температуре °С в течение 30 мин. По окончании инкубации пробы центрифугируют на специализированной центрифуге (для гелевых карт) в стандартных условиях (запрограмированный режим) и оценивают агглютинацию.

Титр гемагглютининов определяют как максимальное разведение препарата, при котором наблюдают распределение агглютинированных эритроцитов в толще гелевой колоки или в её верхней части. Неагглютинированные эритроциты оседают на дно микропробирки. Разведение до содержания белка 25 г/л при определении титра не учитывают.

Критерии приемлемости результатов

- В пробирках (планшетах, микропробирках), содержащих суспензию D-отрицательных эритроцитов человека, агглютинация должна отсутствовать. Наличие агглютинации в этих пробирках (планшетах, микропробирках) свидетельствует о неспецифической реакции; испытания в этим случае необходимо повторить.

- Содержание анти-D антител в положительном стандартном образце должно соответствовать аттестованным величинам.

- Анти-D антитела в отрицательном стандартном образце могут выявляться в титре не более 1:2.

Примечание.

1. Приготовление фосфатного буферного раствора

В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 8,0 г натрия хлорида, 0,76 г безводного натрия гидрофосфата, 0,2 г калия хлорида, 0,2 калия дигидрофосфата. Добавляют 900 мл воды очищенной. Доводят рН до добавлением 1 М раствора натрия гироксида или 1 М раствора хлористоводородной кислоты. Доводят объем раствора до 1000 мл водой очищенной.