Государственный стандарт качества лекарственного средства. Фармакопейная статья ФС 42- "Вакцина чумная живая"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Фармакопейная статья ФС 42-
"Вакцина чумная живая"

Вводится впервые

Вакцина чумная живая, лиофилизат для приготовления суспензии для инъекций, накожного скарификационного нанесения и ингаляций представляет собой живую культуру вакцинного штамма чумного микроба Yersinia pestis EV линии НИИЭГ, высушенную методом лиофилизации в стабилизирующей среде. Вакцина предназначена для профилактики чумы и вызывает развитие специфического иммунитета продолжительностью до одного года.

Особенности производства

Вакцинный штамм Yersinia pestis EV линии НИИЭГ должен обладать типичными морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами; содержать плазмиды pFra, пестициногенности (pPst) и кальцийзависимости (pCad) с молекулярными массами  , и MD соответственно; не должен вызывать гибели морских свинок и потери их массы при введении им дозы микробных клеток (м.к.). Иммуногенность штамма по величине при подкожном введении не должна превышать для морских свинок  м.к., для белых мышей -  м.к.

Перед приготовлением очередной серии вакцинного штамма Y. pestis EV проводят его пассаж через организм морской свинки с последующим отбором типичных колоний, выросших на чашках Петри с агаром Хоттингера из посевов селезенки и регионарных лимфатических узлов.

Технология изготовления вакцины чумной живой, предусматривает получение посевных культур Y. pestis EV I, II и III генерации, процесса накопления биомассы, выращенной для приготовления вакцинной взвеси с необходимой концентрацией с последующим розливом, замораживанием, сублимационным высушиванием, герметизацией и упаковкой препарата. На стадиях приготовления посевных культур определяют рН, концентрацию микробных клеток и отсутствие посторонних микроорганизмов и грибов.

В зависимости от технологии приготовления вакцины в процессе производства используются вспомогательные вещества, разрешенные для медицинского применения: сахароза, желатин, тиомочевина, декстрин, аскорбиновая кислота.

Испытание готового продукта

Описание. Пористая масса серовато-белого цвета.

Подлинность. Должна содержать чистую культуру вакцинного штамма чумного микроба. Определение проводят иммунофлуоресцентным методом с помощью иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих чумных в соответствии с инструкцией по применению. В мазках из препарата, микробные клетки должны светиться по периферии ярко-зеленым цветом.

Время растворения. Должна полностью растворяться в течение 3 мин при добавлении 1 мл 0,9% раствора натрия хлорида.

Растворенный препарат - гомогенная суспензия серовато-белого цвета без посторонних примесей и хлопьев. Определяют визуально.

Время седиментационной устойчивости. Суспензия не должна расслаиваться в течение 5 мин. Определение проводят в соответствие с ОФС "Инъекционные лекарственные формы".

Размер частиц. Суспензия должна свободно проходить в шприц через иглу N 0840. Определение проводят в соответствие с ОФС "Инъекционные лекарственные формы".

рН. От 6,8 до 7,8 Определение проводят потенциометрически в соответствии с ОФС "Ионометрия". Для испытания используют 5 образцов.

Потеря в массе при высушивании. Не более 4%. Определение проводят в соответствии с ОФС "Потеря в массе при высушивании". Для испытания используют 5 образцов.

Средняя масса и отклонение от средней массы. Коэффициент вариации массы вакцины в ампулах должен быть не более 5%. Определение проводят весовым методом. 10 образцов без этикеток обрабатывают смесью спирта с эфиром и помещают в эксикатор на 3 ч. Ампулы (флаконы) вскрывают, взвешивают вместе с препаратом, затем удаляют содержимое и промывают водой. После этого ампулы (флаконы) выдерживают в сушильном шкафу при температуре 100-105°С до постоянной массы. По разности масс ампул с содержимым и без него находят массу вещества и рассчитывают коэффициент вариации (V) в процентах по формуле:

, где

S - стандартное отклонение;

- среднее арифметическое значение массы вещества в ампуле;

X - масса вещества в каждой ампуле;

n - число ампул.

Отсутствие посторонних микроорганизмов и грибов. Вакцина не должна содержать посторонних микроорганизмов и грибов. Определение проводят в соответствии с ОФС "Стерильность" методом прямого посева на тиогликолевой среде.

В ампулу (флакон) с вакциной вносят 2 мл 0,9% раствора натрия хлорида. По 1 мл каждого образца полученной взвеси засевают в пробирки, содержащие по 20 мл тиогликолевой среды. Одну пробирку из каждого образца инкубируют при температуре от 30 до 35°С для выявления аэробных и анаэробных микроорганизмов, другую - при температуре от 20 до 25°С для выявления грибов. Через 5-7 сут из каждой пробирки производят пересев по 0,5 мл на две пробирки, содержащие по 10 мл тиогликолевой среды и инкубируют при указанных выше температурах. Через 14 сут выращивания со дня первичного посева из всех пробирок делают мазки, окрашивают их по Граму, просматривают под микроскопом при увеличении К7х40.

В случае обнаружения хотя бы в одном из 10 просмотренных полей зрения кокков или грамположительных палочек, препарат считается контаминированным посторонней микрофлорой.

При выявлении в мазках грамотрицательных палочек, отличающихся по морфологии от чумного микроба, готовят мазки, которые окрашивают иммуноглобулинами диагностическими флуоресцирующими чумными в соответствии с инструкцией по применению и просматривают в каждом мазке не менее 10 полей зрения под фазовоконтрастным и люминесцентным микроскопами. Если не все микробные клетки, обнаруживаемые под фазовым контрастом, окрашиваются специфически (ярко-зеленое свечение по периферии клеток) препарат считают не выдержавшим испытание.

Специфическая безопасность. Вакцина должна быть безопасной.

Испытание проводят на морской свинке массой  г. Содержимое ампулы (флакона) растворяют 0,9% раствором натрия хлорида до концентрации  м.к./мл по ОСО мутности 42-28-85П (10 МЕ) соответствующего года выпуска, эквивалентного  м.к./мл чумного микроба и вводят подкожно в объеме 1 мл одной морской свинке во внутреннюю поверхность бедра.

На 6-е сутки морскую свинку взвешивают, подвергают эвтаназии, отмечают патологоанатомические изменения, обнаруживаемые при вскрытии. Печень, селезенку, легкие, регионарные лимфатические узлы, кровь и ткани из места введения засевают методом отпечатков на чашку Петри с агаром Хоттингера рН с добавлением натрия сернистокислого в концентрации 0,25 г на 1 л среды, и чашку Петри с агаром Хоттингера рН с добавлением генцианвиолета в концентрации 0,05 г на 1 л среды. Посевы инкубируют при температуре °С в течение 3 сут

Вакцина не должна вызывать у морской свинки потери массы к 6 сут после введения больше, чем на 20%, не должна вызывать видимых патологоанатомических изменений в легких - кровоизлияний, очагов воспаления, гранулем, абсцессов; в посевах крови и легких не должно быть роста чумного микроба. В месте введения допускается развитие кровоизлияния и инфильтрата подкожной клетчатки, переходящих в некроз. Во внутренних органах (селезенка и печень) допустимо развитие ограниченной узелковой реакции.

Специфическая активность.

1. Концентрация микробных клеток (ОК). В препарате должно содержаться от до  м.к. в 1 мл. Определяют в трех образцах для каждой серии. Возможные колебания результатов определений в образцах указаны в частной фармакопейной статье. В стандартную пробирку вносят 0,1 мл разведенного препарата и добавляют 0,9% раствор натрия хлорида до достижения концентрации ОСО мутности 42-28-85П (10 МЕ) соответствующего года выпуска. Объем 0,9% раствора натрия хлорида, использованный при разведении, учитывают при расчете концентрации по формуле:

,

где:

0,1 - объем растворенной вакцины, мл;

n - объем 0,9% раствора натрия хлорида, использованный при разведении пробы, мл;

10 - постоянная величина.

2. Количество живых микробных клеток.

Количество живых микробных клеток должно составлять не менее 25% от общего количества микробных клеток. Колебания результатов определения в отдельных образцах не должны превышать 20% от средней арифметической величины.

При определении содержания живых микробных клеток в вакцине используют концевые химически чистые пипетки и пробирки с 0,9% раствором натрия хлорида, которые должны быть охлаждены до температуры °С.

Содержимое каждой из трех ампул (флаконов) ресуспендируют в зависимости от объема препарата в 0,9% растворе натрия хлорида. После чего делают последовательные десятикратные разведения от до , используя для каждого разведения отдельную пипетку вместимостью 1 мл. Из двух последних пробирок с разведениями и высевают пипеткой по 0,1 мл взвеси на 2 чашки Петри с плотной питательной средой (питательная среда для выделения и культивирования чумного микроба или агар Хоттингера) со стимулятором роста (кровь гемолизированная или натрий сернистокислый).

Учет результатов. Через (72-96) ч инкубации при температуре °С подсчитывают количество колоний для каждого образца, принимая за 100% количество микробных клеток, высеянных, исходя из показателя общей концентрации микробных клеток для данного образца, определенной с помощью ОСО мутности 42-28-85П (10 МЕ) соответствующего года выпуска. За количество жизнеспособных микробных клеток для каждой серии принимают среднюю арифметическую определений для трех ампул (флаконов).

Исходя из количества жизнеспособных микробных клеток в ампуле (флаконе) с вакциной рассчитывают количество доз и объем растворителя каждой серии для приготовления суспензии для инъекций, накожного скарификационного нанесения и ингаляций.

Для достоверности полученных результатов параллельно используют стандартный образец вакцины чумной живой.

3. Иммуногенность.

вакцины для морских свинок не должна превышать , для белых мышей - живых микробных клеток. Проверяют на морских свинках массой  г и на белых нелинейных мышах массой г. Вакцину разводят с таким расчетом, чтобы в 1 мл содержалось живых м.к. Исходя из заранее определенного количества живых м.к., вакцину доводят для иммунизации морских свинок до концентраций  м.к./мл,  м.к./мл,  м.к./мл и  м.к./мл; белых мышей - до концентраций  м.к./мл,  м.к./мл,  м.к./мл и  м.к./мл. Каждую дозу препарата вводят однократно 6 животным. Морских свинок иммунизируют подкожно во внутреннюю поверхность левого бедра в объеме 0,5 мл; белых мышей - в объеме 0,2 мл дозами и живых м.к.

Для определения фактического содержания живых микробных клеток в иммунизирующих дозах взвесь содержащую  м.к./мл, используемую при иммунизации морских свинок или концентрацией  м.к./мл - для иммунизации белых мышей, разводят до концентрации  м.к./мл. По 0,1 мл этого разведения (100 м.к.) высевают на 3 чашки Петри с одним из вышеперечисленных агаров и инкубируют при температуре °С в течение 48 ч. Количество выросших колоний на чашках учитывают при вычислении испытуемой серии.

Подкожное заражение морских свинок проводят во внутреннюю поверхность правого бедра на 21-е сут, мышей - в ту же область на 7-е или 21-е сут после иммунизации. Заражающая доза для иммунизированных вакциной животных составляет 200 DCL (Dosis certa letalis = ) вирулентного штамма чумного микроба, 1 DCL которого не должна превышать 100 микробных клеток.

Подготовка заражающего штамма Y. pestis 231 описана в частной фармакопейной статье предприятия.

Для заражения неиммунных (контрольных) животных используют взвесь концентрацией 50 м.к./мл в объеме 0,5 мл для морских свинок и 125 м.к./мл в объеме 0,2 мл для белых мышей, что соответствует 1 DCL.

Для определения фактического содержания микробных клеток заражающего штамма по 0,1 мл взвеси культуры Y. pestis 231 содержащей  м.к./мл высевают на 3 чашки Петри с агаром Хоттингера и равномерно распределяют по всей поверхности среды методом "обкатки" чашек. Посевы инкубируют при температуре °С в течение 48 ч, после чего подсчитывают количество выросших колоний.

Наблюдение за зараженными животными ведут в течение 20 сут. Все контрольные животные должны погибнуть от чумы в течение 10 сут. Погибших животных вскрывают, органы и ткани (у морских свинок берут пробы из места введения, регионарного пахового лимфатического узла, печени, селезенки, легкого, верхушки сердца; у белых мышей - из селезенки), высевая их методом отпечатков на чашки Петри с агаром Хоттингера с добавлением генцианвиолета и агаром Хоттингера с натрием сернистокислым. Чашки Петри инкубируют при температуре °С. Учет результатов проводят через 24-48 ч.

Павшими от чумы считают только тех животных, из органов которых при высеве выделяется культура Y. pestis.

вычисляют по формуле:

, где:

S - логарифм кратности разведений;

- логарифм максимальной иммунизирующей (фактической) дозы;

- отношение числа животных, выживших при иммунизации данной дозой, к общему числу, которым эта доза была введена;

- сумма значений , найденных для всех испытанных доз.

Если все контрольные животные не погибнут, или значение будет более допустимого, контроль повторяют на таком же количестве животных. Если при повторном испытании значение будет более допустимого, препарат считают не выдержавшим испытание.

Термостабильность.

Показатель термостабильности должен быть не менее 4 сут. Определение осуществляют после хранения вакцины при температуре °С в течение 14 сут, используя 3 образца.

Методика определения количества живых микробных клеток изложена в разделе "Специфическая активность". Показатель термостабильности рассчитывают по формуле:

, где:

t - показатель термостабильности в сут;

- логарифм первоначального числа живых м. к. в 1 мл;

- логарифм числа живых микробных клеток в 1 мл через 14 сут хранения вакцины при температуре °С;

0,3 - постоянная величина;

14 - срок хранения вакцины при температуре °С в сут.

Маркировка и упаковка. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты (средства)".

Хранение. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты (средства)".