Государственный стандарт качества лекарственного средства. Фармакопейная статья ФС 42- "Вакцина лептоспирозная концентрированная инактивированная жидкая"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Фармакопейная статья ФС 42-
"Вакцина лептоспирозная концентрированная инактивированная жидкая"

Вводится впервые

Вакцина лептоспирозная концентрированная инактивированная жидкая, суспензия для подкожного введения представляет собой смесь инактивированных формальдегидом концентрированных культур лептоспир четырех серогрупп (Leptospira interrogans Icterohaemorrhagiae, L. interrogans Grippotyphosa, L. interrogans Pomona, L. interrogans Sejroe). Вакцина предназначена для профилактики лептоспироза и вызывает развитие специфического иммунитета продолжительностью до 1 года.

Особенности производства

Технология производства вакцины лептоспирозной концентрированной инактивированной жидкой предусматривает приготовление питательной среды с кроличьей сывороткой, приготовление полусинтетической среды с альбумином сыворотки крови человека, накопление концентрированной микробной массы, сведение стандартизованной микробной массы 4-х штаммов лептоспир в вакцину, розлив и упаковку препарата. Вакцинные штаммы лептоспир должны расти на питательной среде Терских с кроличьей сывороткой и полусинтетической питательной среде с альбумином сыворотки крови человека, быть подвижными, обладать типичными культурально-морфологическими и серологическими свойствами, быть специфичными в реакции микроагглютингации (РМА) и иммуногенными для золотистых хомячков.

В качестве консерванта используется формалин.

На стадиях производства вакцины проводят контроль роста лептоспир и чистоты культуры, подвижности лептоспир, определение концентрации, контроль стерильности, безвредности, токсичности, подлинности, специфической активности и содержания формалина.

Испытания готового продукта

Описание. Бесцветная слегка опалесцирующая жидкость, с легко разбивающимся осадком при встряхивании.

Подлинность. Препарат должен обладать иммунологической активностью - вызывать у золотистых хомяков образование специфических антител, выявляемых в РМА со штаммами лептоспир четырех серогрупп (Leptospira interrogans Icterohaemorrhagiae, L. interrogans Grippotyphosa, L. interrogans Pomona, L. interrogans Sejroe) в титре не менее чем 1:100.

Методика проведения испытания описана в разделе "Специфическая активность".

Прозрачность. Оптическая плотность препарата должна быть не менее 0,03. В кювету с толщиной слоя 3 мм помещают 1,5 мл вакцины, тщательно перемешивают и измеряют оптическую плотность на фотометре при длине волны 315 нм по сравнению с водой.

Механические включения. В соответствии с ОФС "Видимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения и глазных лекарственных формах". Определение проводят визуально. Требование на отсутствие видимых механических частиц указывают в частной фармакопейной статье предприятия.

pH. От 7,2 до 7,6. Определение проводят потенциометрически в соответствии с ОФС "Ионометрия". Для испытания используют содержимое 5 образцов.

Извлекаемый объем. Не менее номинального. Испытание проводят в соответствии с ОФС "Извлекаемый объем лекарственных форм для парентерального применения"

Время седиментационной устойчивости. Суспензия не должна расслаиваться в течение 5 мин. Определение проводят в соответствие с ОФС "Инъекционные лекарственные формы".

Размер частиц. Суспензия должна свободно проходить в шприц через иглу N 0840. Определение проводят в соответствие с ОФС "Инъекционные лекарственные формы".

Формальдегид. Содержание формальдегида не должно превышать 0,03%. Для испытания используют 5 образцов. Определение проводят колориметрическим методом в соответствии с ОФС "Определение формальдегида".

Стерильность. Препарат должен быть стерильным. Определение проводят в соответствии с ОФС "Стерильность", методом прямого посева.

Специфическая стерильность. Не должна содержать живых лептоспир. Определение проводят путем посева 0,2 мл препарата в 3 бактериологические пробирки с 7 мл фосфатно-сывороточной среды Терских. Состав среды Терских изложен в частной фармакопейной статье предприятия.

Пробирки с посевами инкубируют при температуре °С в течение 20 сут. Затем делают из посевов мазки по методике, описанной в разделе "специфическая безопасность".

Просматривают не менее 30 полей зрения в темном поле микроскопа при увеличении в 200 раз. В посевах не должны обнаруживаться живые (подвижные) лептоспиры. При обнаружении живых лептоспир хотя бы в одном посеве препарат считают не выдержавшим испытание.

Аномальная токсичность. Препарат должен быть нетоксичным. Препарат вводят животным по 0,5 мл: белым мышам внутрибрюшинно, а морским свинкам - подкожно. Определение проводят в соответствии с ОФС "Аномальная токсичность", раздел "Тест для вакцин и сывороток".

Специфическая безопасность. Вакцина должна быть безопасной, и не должна содержать живых лептоспир.

Для проведения испытания используют золотистых хомячков массой  г. Трем животным однократно внутрибрюшинно вводят по 0,5 мл вакцины. Наблюдение за животными ведут в течение 20 сут. К концу срока хомячков обескровливают декапитацией. Кровь используют для получения иммунной сыворотки и исследования ее в РМА при определении специфической активности вакцины. После обескровливания животных проводят их вскрытие и затем пастеровской пипеткой делают посев коркового слоя почек в бактериологические пробирки со средой Терских.

Вскрытие животных и забор материала для посева проводят при строгом соблюдении правил асептики. Посевы инкубируют в течение 7 сут в термостате при температуре °С. Затем отбирают 0,02 мл микробной взвеси и просматривают не менее 30 полей зрения в темном поле микроскопа при увеличении в 200 раз. При обнаружении роста лептоспир хотя бы в одном посеве препарат считают не выдержавшим испытание.

Специфическая активность. Препарат должен обладать иммунологической активностью - вызывать у золотистых хомяков образование специфических антител, выявляемых в РМА со штаммами лептоспир четырех серогрупп в титре не менее чем 1:100; защищать не менее 3 из 4 животных от заражения вирулентной культурой Leptospira interrogans Icterohaemorrhagiae copenhageni. Трем золотистым хомячкам массой (22_3) г однократно внутрибрюшинно вводят по 0,5 мл вакцины. Через 20 сут после иммунизации животных обескровливают декапитацией. Кровь собирают во флаконы (пробирки) и инкубируют в термостате в течение 30-40 мин при температуре (37_1)°С. Затем выдерживают в холодильнике при температуре (6_2) °С в течение 24 - 48 ч. Полученную иммунную сыворотку отбирают в стерильные пробирки и исследуют в РМА для выявления специфических антител к штаммам лептоспир четырех серогрупп, входящих в состав вакцины.

Проведение РМА. Реакцию микроагглютинации ставят в лунках полистиролового планшета. В лунки с А1 по А4 вносят по 0,2 мл анализируемой сыворотки, разведенной 1:25 0,9% раствором натрия хлорида. В лунки с В1-В4 по F1-F4 вносят по 0,1 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Разведение сыворотки осуществляют автоматической пипеткой в направлении лунок от А к F, перенося по 0,1 мл каждого разведения, начиная с 1:25 до 1:800.

В качестве антигенов используют 7-12 суточные культуры лептоспир четырех серогрупп (Leptospira interrogans Icterohaemorrhagiae, L. interrogans Grippotyphosa, L. interrogans Pomona, L. interrogans Sejroe), выращенные на среде Терских. При нанесении 0,02 мл культуры каждой серогруппы на предметное стекло количество лептоспир должно быть не менее 100-150 клеток в поле зрения микроскопа при двухсоткратном увеличении.

После разведения сыворотки в каждый ряд лунок от А1 до F1, от А2 до F2, от А3 до F3 и от А4 до F4 вносят по 0,1 мл культуры лептоспир соответствующей серогруппы. После добавления антигенов получают разведение сывороток от 1:50 до 1:1600. Одновременно проводят контроль культур: в 4 лунки (Н1, Н2, Н3, Н4) вносят по 0,1 мл 0,9% раствора натрия хлорида и по 0,1 мл живой культуры лептоспир каждой серогруппы в отдельности. Планшет выдерживают в течение 1 ч при температуре °С. Из лунок планшета с определенной серогруппой отбирают по 0,02 мл смеси сыворотки и культуры лептоспир, наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и микроскопируют в темном поле зрения при увеличении в 200 раз.

Результаты реакции оценивают по условной трехкрестовой системе: + - 1/3 лептоспир агглютинированы;

++ - от 1/3 до 2/3 лептоспир агглютинированы;

+++ - более 2/3 или все лептоспиры агглютинированы;

контроль - агглютинация отсутствует, все клетки лептоспир находятся в свободном состоянии.

Положительной реакцией микроагглютинации с живыми культурами лептоспир четырех серогрупп считается реакция не менее чем на один крест.

Тест активной защиты. Четырем золотистым хомячкам массой  г однократно внутрибрюшинно вводят по 0,5 мл вакцины. Через 20 сут иммуннизированных и четырех неиммуннизированных (контрольных) животных заражают внутрибрюшинно вирулентной культурой L. interrogans Icterohaemorrhagiae copenhageni с содержанием 100-150 лептоспир в поле зрения микроскопа (х200) в объеме 1 мл. Наблюдение за животными ведут в течение 7 сут.

В контрольной группе не менее трех животных должны заболеть или погибнуть, три из четырех иммуннизированных и зараженных животных не должны заболеть или погибнуть. Если выживают менее 3 иммуннизированных и зараженных животных испытание повторяют. При получении аналогичных результатов, препарат считают не выдержавшим испытание.

Маркировка и упаковка. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты (средства)".

Хранение. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты (средства)".