Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья ОФС 42- "Иммуногенность адсорбированного дифтерийного анатоксина "

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Общая фармакопейная статья ОФС 42-
"Иммуногенность адсорбированного дифтерийного анатоксина "

Вводится впервые

Специфическую (иммуногенную) активность адсорбированного дифтерийного анатоксина, входящего в состав комбинированных вакцин, определяют по его способности защищать иммунизированных животных от заражения дифтерийным токсином и выражают в количестве Международных единиц (МЕ) активности, содержащихся в 1 мл или в прививочной дозе (0,5 мл). Специфическую активность дифтерийного анатоксина в МЕ/мл рассчитывают путем сопоставления его количества и количества соответствующего референс-препарата, калиброванного в МЕ, необходимых для защиты 50% животных от летального заражения дифтерийным токсином. Для определения специфической активности используют метод множественных разведений. При стабильно воспроизводимых показателях специфической активности адсорбированного дифтерийного анатоксина и стандартной технологии производства возможно использование метода с одним разведением.

Метод множественных разведений

Разными дозами вакцины иммунизируют не менее 3 групп морских свинок по 10 животных в группе. Не менее 3 аналогичных групп животных иммунизируют разными дозами референс-препарата, калиброванного в МЕ. Разведения вакцины и референс-препаратов выбирают таким образом, чтобы наименьшая доза защищала от заражения не более 20%, а наибольшая доза - не менее 80% иммунизированных животных.

Через 28 сут иммунизированным животным вводят по 100 дифтерийного токсина. Наблюдение проводят в течение 4 сут, регистрируя число выживших животных в каждой группе, и рассчитывают величины для вакцины и референс-препарата. На основании полученных результатов определяют количество МЕ в 1 мл вакцины.

Материалы и животные:

- референс-препарат (стандартный образец активности адсорбированного дифтерийного анатоксина, калиброванный в МЕ по соответствующему Международному стандартному образцу)

- испытуемая вакцина,

- дифтерийный токсин с предварительно установленной дозой (статистически определяемая доза токсина, вызывающая гибель 50% животных в течение 4 сут),

- морские свинки массой тела 250-350 г обоего пола

Приготовление разведений референс-препарата

Референс-препарат разводят стерильным 0,9% раствором натрия хлорида (рН ) и готовят не менее трех последовательных разведений с двойным шагом (например: 1, 2 и 4 МЕ/мл).

Приготовление разведений вакцины

Разведения вакцины готовят, соблюдая те же условия, что и при приготовлении разведений референс-препарата.

Иммунизация животных

Разведения референс-препарата и вакцины вводят морским свинкам по 1мл подкожно в бок.

Введение дифтерийного токсина

По истечении 28 сут всем иммунизированным животным вводят подкожно в область грудины 1 мл дифтерийного токсина, содержащего 100 . Опыт сопровождают контролем величины дифтерийного токсина. Для этого неиммунизированным морским свинкам из той же партии, распределенным в 3 группы (не менее 5 свинок в каждой группе), вводят дифтерийный токсин в дозах 0,5, 1 и 2 . За иммунизированными животными и животными контрольной группы наблюдают 4 сут, регистрируя число выживших в каждой группе. На основании полученных результатов проводят расчет иммуногенной активности дифтерийного анатоксина с помощью программы "Probit" или по формуле Кербера (1), определяя величины для референс-препарата (в МЕ) и испытуемой вакцины (в мл).

Примечание: для расчета результатов испытаний с помощью программы "Probit" следует использовать не менее 3 разведений испытуемых образцов, при которых значения Li отличны от 0 и 1.

Формула Кербера:

(1)

где

- величина максимальной из испытанных доз;

- логарифм кратности разведения (отношение большей дозы к следующей за ней меньшей дозе);

Li - отношение количества выживших животных к общему числу животных, получивших данную дозу;

- сумма значений Li, найденных для всех испытуемых доз.

токсина рассчитывают по той же формуле, где

Li - отношение количества павших животных к общему числу животных, получивших данную дозу токсина.

Испытание считается проведенным правильно, если:

- вычисленные значения находится между наибольшей и наименьшей дозами препаратов, введенными животным;

- пределы доверительного интервала (Р=0,95) не меньше чем 50% и не больше чем 200% от величины вычисленной активности;

- доза введенного дифтерийного токсина приблизительно равно 100 .

Метод с одним разведением

Принцип метода заключается в сравнении активности единичных разведений вакцины и референс-препарата, калиброванного в МЕ.

По результатам ранее проведенных испытаний с тремя разведениями выбирают дозу референс-препарата, обеспечивающую выживаемость 10-20% иммунизированных животных при заражении разрешающей дозой токсина. Разведение вакцины осуществляют с таким расчетом, чтобы получить подтверждение того, что ее активность значительно выше минимально требуемой.

Животных делят на две группы (не менее 12 животных в каждой), одну из которых иммунизируют вакциной, а другую референс-препаратом. Препараты вводят подкожно в объеме 1 мл. Через 28 сут всем иммунизированным животным вводят разрешающую дозу дифтерийного токсина, равную 100 , в объеме 1 мл. Опыт сопровождают контролем величины дифтерийного токсина. За животными наблюдают 4 сут, регистрируя число выживших в каждой группе. Результаты выражают как отношение числа выживших морских свинок к общему числу животных в группе, иммунизированных вакциной или референс-препаратом. В опытной группе количество выживших животных должно достоверно быть выше, чем в контроле. Достоверность различия определяют с помощью точного критерия Фишера (одностороннего, Р<0,05). При значении различия считаются недостоверными.

Таблица 1 - расчета значения доверительного интервала (Р)

Количество испытуемых животных	Выжило	Пало	Всего
Опыт	a	b	T
Контроль	c	d	R
Всего	n+	n-	N

где "!" - знак факториала (означает произведение всех натуральных чисел от 1 до числа, стоящего перед знаком "!", включительно).