Государственный стандарт качества лекарственного средства. Фармакопейная статья ФС 42- "Вакцина холерная бивалентная химическая, таблетки покрытые кишечнорастворимой оболочкой"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Фармакопейная статья ФС 42-
"Вакцина холерная бивалентная химическая, таблетки покрытые кишечнорастворимой оболочкой"

Вводится впервые

Вакцина холерная бивалентная химическая, таблетки, покрытые кишечнорастворимой оболочкой, представляет собой смесь холерогена- анатоксина и О-антигена, полученных из инактивированных штаммов V.cholerae О1 классического биовара 569 В серовара Инаба и М-41 серовара Огава. Вакцина предназначена для профилактики холеры и вызывает развитие специфического иммунитета длительностью до 6 месяцев.

Особенности производства

Для производства вакцины используют штаммы V. cholerae О1 - гиперпродуценты холерного токсина, несущие гены, ответственные за синтез холерного токсина (ctх A, B) и О-антигена. Производственные штаммы V. cholerae О1, должны быть типичными для S-формы по морфологическим, культуральным, биохимическим и серологическим свойствам и обладать холерогенными, токсигенными, иммуногенными и вирулентными свойствами.

Технология производства вакцины холерной бивалентной химической предусматривает культивирование штаммов-продуцентов в жидких питательных средах (3 пассажа), инактивирование культур формалином, последующее выделение из полученной биомассы V. cholerae О1 серовара Инаба и серовара Огава специфических фракций холерогена-анатоксина и О-антигенов, их очистка, концентрирование сернокислым аммонием, сублимационное высушивание, смешивание с наполнителями - сахарозой, крахмалом, тальком, кальция стеаратом, таблетирование, покрытие таблеток кислотоустойчивой оболочкой из целлацефата (ацетилфталилцеллюлоза). В процессе производства вакцины проводят контроль чистоты и концентрации бактериальной культуры, контроль стерильности инактивированной культуры, контроль диализа специфических фракций.

Испытание готового продукта

Описание. Таблетка - серовато-желтая компактная масса, покрытая светлой блестящей кислотоустойчивой оболочкой. Определение проводят визуально.

Подлинность. Одна таблетка должна содержать единиц связывания анатоксина (ЕС) и иметь обратный показатель титра в РНГА О-антигена штаммов V. cholerae О1 не менее 2000 условных единиц. Методика определения изложена в разделе "Специфическая активность".

Распадаемость. Определение проводят в соответствии с ОФС "Распадаемость таблеток и капсул".

Средняя масса таблетки. От 0,285 г до 0,315 г. Определение проводят в соответствии с ОФС "Однородность массы дозированных лекарственных форм".

рН растворенного препарата. От 6,7 до 7,4. Таблетку растворяют в 50 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Определение проводят потенциометрически в соответствии с ОФС "Ионометрия".

Потеря в массе при высушивании. Не более 5%. На каждый из двух параллельных анализов используют навеску  г из 3-х измельченных таблеток. Определение проводят в соответствии с ОФС "Потеря в массе при высушивании".

Ионы аммония и сульфат - ионы. Не допускается наличие ионов аммония и сульфат-ионов. На каждое испытание используют по 2 таблетки. Таблетки растирают в ступке в 10 мл 0,9% раствора натрия хлорида до получения суспензии и центрифугируют в течение 20 мин при 2000 об/мин.

Для определения сульфат - ионов к 1 мл пробы добавляют 3,5 мл воды очищенной, 0,5 мл 5% раствора хлорида бария и перемешивают. Через 15 мин измеряют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 5 мм по сравнению с контрольным раствором, содержащим 1 мл препарата и 4 мл воды. Расчет содержания сульфат - ионов проводят по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика. Готовят основной раствор калия сульфата, содержащий 1 мг/мл сульфат-ионов: 1,8140 г калия сульфата, высушенного до постоянной массы при температуре 100-105°С, растворяют в воде очищенной в мерной колбе вместимостью 1 л и доводят объем раствора до метки. Перед определением основной раствор разводят водой очищенной в 10 раз. К 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5 полученного раствора (50-450 мкг сульфат-ионов) с интервалом 0,5 мл прибавляют воду очищенную до объема 4,5 мл, 0,5 мл 5%-ного раствора бария хлорида и проводят анализ, как указано выше. Калибровочный график воспроизводится при каждом анализе.

Для определения ионов аммония к 1 мл пробы добавляют 8,8 мл воды очищенной, 0,2 мл реактива Несслера и перемешивают. Определяют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре при длине волны 400 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм по сравнению с контрольным раствором, содержащим 1 мл препарата и 9 мл воды. Расчет содержания сульфат - ионов проводят по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика. Готовят основной раствор аммония хлорида, содержащий 200 мкг/мл ионов аммония: 0,5931 аммония хлорида, высушенного до постоянной массы в эксикаторе в присутствии кальция хлорида безводного, растворяют в воде очищеннойв мерной колбе вместимостью 1 л и доводят объем раствора до метки. Перед определением основной раствор разводят водой очищенной в 100 раз (2 мкг/мл ионов аммония). К 2,5; 3,5; 4,5; 5,5; 6,5; 7,5 полученного раствора прибавляют воду до объема 9,8 мл, прибавляют 0,2 мл раствора Несслера и проводят анализ, как указано выше. Калибровочный график воспроизводится при каждом анализе.

Приготовление реактива Несслера. В мерную колбу вместимостью 100 мл наливают воду очищенную до метки и используют только эту воду. 10 г ртути йодида растирают в фарфоровой ступке с небольшим количеством воды и переливают в банку из темного стекла. Ступку ополаскивают небольшим количеством воды и сливают в ту же банку. Прибавляют 5 г калия йодида. В оставшейся воде растворяют 20 г натрия гидроксида и после охлаждения раствора переливают его в ту же емкость. В течение нескольких дней осаждают избыток ртутных солей. Прозрачную жидкость осторожно сливают в темную склянку. Реактив хранят в темном месте.

Формальдегид. Не более 0,2%. Для испытания используют 2 таблетки. Таблетки растирают в ступке в 10 мл воды очищенной до получения суспензии, центрифугируют в течении 15 мин при 6000 об/мин. Отбирают 2 мл прозрачной надосадочной жидкости и доводят водой очищенной до 5 мл. Определение проводят в соответствии с ОФС "Определение формальдегида".

Микробиологическая чистота. В одной таблетке допускается не более 1000 колоний непатогенных микроорганизмов. Вакцина не должна содержать патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. За один образец принимают 5 таблеток. Определение проводят в соответствии с правилами асептики. Каждую таблетку берут пинцетом, ополаскивают 0,9% раствором натрия хлорида рН  и помещают в фарфоровую ступку с пестиком, прикрытую марлевой салфеткой, вносят 20 мл 0,9% раствора натрия хлорида, тщательно растирают в течение 1-2 мин, переносят во флакон вместимостью 100 мл, перемешивают до образования гомогенной суспензии. По 0,2 мл высевают пипеткой на 10 чашек Петри с мясо-пептонным агаром рН , на 5 чашек с мясо-пептонным агаром с 3-5% дефибринированной бараньей крови и по 1 мл на 50 мл 10% желчного бульона рН . Посевы инкубируют при температуре °С в течение 48 ч. После инкубации по 0,2 мл из флакона с желчным бульоном высевают на 5 чашек с агаром Эндо и инкубируют в течение 48 ч при температуре °С.

Учет результатов. Подсчитывают число колоний выросших на 10 чашках с мясо-пептонным агаром. Если при посеве на мясо-пептонный агар выросло более 1000 колоний непатогенных микробов на 1 таблетку, препарат контролируют повторно на удвоенном количестве образцов. Если при повторном контроле число выросших колоний превысит 1000, серию вакцины бракуют.

Пример расчета: 5 таблеток от одной серии растворены в 20 мл 0,9% раствора натрия хлорида, то есть 1 таблетка - в 4 мл; делают высев в объеме 0,2 мл, то есть на чашку высевают 0,05 таблетки, на десять чашек с мясо-пептонным агаром - 0,5 таблетки. Если сумма выросших колоний составляет 500, то на одну таблетку - 1000 колоний.

На мясо-пептонном агаре с дефибринированной бараньей кровью не допускается наличие колоний, дающих зону гемолиза. На среде Эндо должны отсутствовать, как бесцветные, так и красные с металлическим блеском колонии.

Аномальная токсичность. Вакцина должна быть нетоксичной. Испытание проводят на беспородных белых мышах обоего пола массой  г.

Соблюдая условия асептики, 2 таблетки от серии берут пинцетом, ополаскивают 0,9% раствором натрия хлорида, помещают в фарфоровую ступку с пестиком, добавляют 160 мл 0,9% раствора натрия хлорида и тщательно растирают таблетки в течение 1-2 мин, содержимое переносят во флакон вместимостью 100 мл и тщательно перемешивают до образования гомогенной суспензии. Полученную суспензию вводят подкожно в область спины вдоль позвоночника 10 животным в объеме 0,5 мл. Животные должны оставаться живыми в течение 7 сут без видимых признаков заболевания. Масса каждого животного в день окончания наблюдения не должна быть меньше исходной. Если в течение периода наблюдения регистрируется гибель, уменьшение массы, заболевание, развитие некроза или абсцесса в месте введения хотя бы у одного животного, испытание повторяют на удвоенном количестве белых мышей. Повторное испытание считается удовлетворительным, если препарат отвечает установленным требованиям.

Специфическая безопасность. Вакцина должна быть специфически безопасной.

Определение проводят на двух кроликах массой  кг со светлой кожей. За 24 ч до постановки испытания ножницами выстригают шерсть на боковой поверхности тела размером 30x15 см, затем остатки шерсти удаляют депилаторием.

Испытанию подлежит смесь из 3-х таблеток. Таблетки пинцетом помещают в ступку и растирают в 75 мл 0,9% раствором натрия хлорида до получения гомогенной суспензии (разведение 1:25). Затем 1 мл суспензии вносят в пробирку, содержащую 9 мл 0,9% раствора натрия хлорида, получая разведение вакцины 1:250. Далее в ряд пробирок вносят по 1 мл этого разведения и добавляют 3 мл, 5 мл и 7 мл 0,9% раствора натрия хлорида, получая разведения 1:1000, 1:1500 и 1:2000. По 0,2 мл каждого разведения переносят в пробирки, добавляют к ним по 0,6 мл 0,9% раствора натрия хлорида, получая конечные разведения 1:4000, 1:6000, 1:8000, которые соответствуют 4000, 6000, 8000 ЕС вакцины в 0,1 мл или соответственно 40 000, 60 000 и 80 000 ЕС/мл. Каждое разведение вводят в объеме 0,1 мл внутрикожно двум кроликам на расстоянии 30 мм друг от друга, начиная с последнего разведения 1:8000.

Учет результатов проводят через 24 ч, измеряя размер папул линейкой. Вакцина специфически безопасна, если при внутрикожном введении в разведении не более 1:6000 (60000 ЕС/мл) не образуются или образуются папулы диаметром до 10 мм. Если размер папул хотя бы у одного кролика больше 10 мм, испытание повторяют на том же количестве животных. Если при введении вакцины в разведении 1:8000 наблюдаются папулы диаметром 5 мм и более, серию вакцины бракуют.

Специфическая активность.

1. Антигенная активность по анатоксиносвязыванию. Одна таблетка должна содержать единиц связывания анатоксина (ЕС). Испытание проводят на двух кроликах, массой ( кг) со светлой кожей. Подготовка боковой поверхности кожи кролика изложена в разделе "Специфическая безопасность". В испытании используют стандартные образцы предприятия (СОП) холерного тест-токсина сухого (далее тест-токсин) и сыворотки антихолерогенной сухой (далее сыворотка).

Разведение СОП сыворотки антихолерогенной сухой. Содержимое ампулы СОП сыворотки антихолерогенной сухой растворяют в 1 мл воды очищенной, переносят во флакон объемом 100 мл и разводят водой очищенной до получения разведения сыворотки 80 АЕ/мл.

Разведение СОП холерного тест-токсина сухого. В ампулу СОП холерного тест-токсина сухого вносят 1 мл воды очищенной, переносят во флакон объемом 100 мл и разводят водой очищенной до получения 20 опытных доз в 1 мл раствора.

Определение ЕС проводят в смеси из 3-х таблеток. Таблетки растирают в ступке в 75 мл 0,9% раствора натрия хлорида до получения гомогенной суспензии (разведение 1:25). Затем 1 мл переносят в пробирку и добавляют 9 мл 0,9% раствора натрия хлорида, получая разведение 1:250. Далее делают ряд последовательных разведений 1:1000, 1:1500, 1:2000, 1:2500, 1:3000 и 1:3500 в 0,9% растворе натрия хлорида. По 0,2 мл каждого разведения переносят в пробирки и добавляют по 0,2 мл сыворотки, содержащей 80 АЕ/мл, получая разведения вакцины от 1:2000 до 1:7000. Пробирки выдерживают в течение 30 мин при температуре °С. После инкубации в каждую пробирку добавляют по 0,4 мл 20 опытных доз/мл тест-токсина, получая разведения вакцины от 1:4000 до 1:14000. Пробирки встряхивают и выдерживают при температуре °С в течение 30 мин. По 0,1 мл содержимого каждой пробирки вводят внутрикожно на расстоянии 30 мм 2 кроликам в депилированный участок кожи, начиная с разведения 1:14000.

Одновременно на тех же кроликах определяют 1 АЕ сыворотки. В ряде пробирок готовят разведения антитоксической сыворотки в 0,9% растворе натрия хлорида, содержащие 80 АЕ, 60 АЕ, 40 АЕ, 30 АЕ и 20 АЕ в 1 мл. По 0,2 мл каждого разведения сыворотки переносят в пробирки и добавляют по 0,2 мл 0,9% раствора натрия хлорида и по 0,4 мл из разведения тест-токсина, содержащего 20 опытных доз/мл, получая содержание в сыворотке 2 АЕ, 1,5 АЕ, 1 АЕ, 0,75 АЕ, 0,5 АЕ. Пробирки выдерживают при температуре °С в течение 30 мин. После инкубации по 0,1 мл каждого разведения вводят внутрикожно двум кроликам начиная с 2 АЕ (контрольный ряд).

Учет результатов. Учет проводят через 24 ч. Положительной реакцией в опытных рядах при введении разведений 1:8000, 1:10000, 1:12000 считают зону отека диаметром от 5 до 10 мм. Размер папулы в опытном ряду должен быть равен размеру папулы в контрольном ряду, где 1 опытная доза тест-токсина связяла 1 АЕ сыворотки.

Принимая во внимание значительные колебания индивидуальной чувствительности кожи кроликов, расчет антигенной активности по ЕС проводят по одному из четырех вариантов:

1 вариант - положительная реакция в контрольном ряду наблюдается с сывороткой 1 АЕ; 0,75АЕ и 0,5 АЕ и отсутствует в разведениях 2 АЕ и 1,5АЕ, следовательно, 1 опытная доза тест-токсина связала 1 АЕ сыворотки. Наибольшее разведение вакцины, при введении которой наблюдается положительная кожная реакция у двух кроликов в опытном ряду, например, 1:8000, следовательно, в 0,1 мл вакцины содержится 8000 ЕС или 80000 ЕС в 1 мл (в 1 таблетке).

2 вариант - положительная реакция в контрольном ряду наблюдается в разведениях сыворотки 0,75 и 0,5 АЕ, следовательно, 1 опытная доза тест-токсина связала 1,25 АЕ (2 АЕ-0,75 АЕ) сыворотки. Наибольшее разведение вакцины, при введении которого наблюдается положительная кожная реакция у двух кроликов в опытном ряду, например, 1:8000. Так как токсин связал 1,25 АЕ, расчет количества ЕС в препарате проводят следующим образом: 1,25х8000, следовательно, в 0,1 мл содержится 10000 ЕС или 100000 ЕС в 1 мл (в 1 таблетке).

3 вариант - положительная реакция в контрольном ряду наблюдается в разведениях сыворотки 1,5 АЕ; 1АЕ; 0,75 АЕ и 0,5 АЕ и отсутствует только с разведением 2 АЕ, следовательно, 1 опытная доза тест-токсина связала 0,5 АЕ (2 АЕ-1,5 АЕ) сыворотки. Например, наибольшее разведение вакцины, при введении которой наблюдается положительная кожная реакция у двух кроликов в опытном ряду, 1:8000. Так как токсин связал 0,5 АЕ, расчет количества ЕС в препарате проводят следующим образом: 0,5х8000, следовательно, в 0,1 мл содержится 4000 ЕС или 40000 ЕС в 1 мл (в 1 таблетке).

4 вариант - если положительная реакция в контрольном ряду наблюдается хотя бы у одного кролика при разведении 0,5 АЕ или во всех разведениях сыворотки с 2 АЕ; 1,5АЕ; 1АЕ; 0,75АЕ по 0,5 АЕ, то учет результата не проводят и постановку испытания повторяют на 2 кроликах. Повторное испытание считается удовлетворительным, если препарат отвечает установленным требованиям по вариантам 1, 2 или 3.

2. Содержание О-антигена. Одна таблетка должна содержать не менее 2000 условных единиц О-антигена штаммов V. cholerae О1 (обратный показатель титра в РНГА).

Для испытания используют 3 таблетки. Каждую таблетку тщательно растирают в отдельной ступке, добавляют 10 мл воды очищенной. Содержимое каждой ступки переносят в отдельные флаконы вместимостью 100 мл и оставляют для осаждения на 10-15 мин при температуре °С. По 5 мл надосадочной жидкости из каждого флакона переносят в пробирки и добавляют по 2 капли 40% раствора натрия гидроксида, выдерживают на водяной бане при температуре °С в течение 2 мин, охлаждают водопроводной водой до температуры °С и добавляют пастеровской пипеткой по капле 0,5% раствора розоловой кислоты до окрашивания растворов в ярко-розовый цвет. Далее в пробирки добавляют по каплям (2-4) "ледяную" уксусную кислоту до перехода окрашивания растворов в желтый цвет. Затем - по каплям (2-7) 10% раствор натрия углекислого до появления бледно-розового окрашивания. Для постановки РНГА каждую пробу вакцины дополнительно разводят в 1:3 и 1:7. Для постановки РНГА используют неразведенную (цельную) пробу и полученные разведения.

Постановка РНГА (микрометод). В 8 лунок шести рядов каждой пластины вносят по 0,025 мл 0,9% раствор а натрия хлорида. В первые лунки каждого ряда вносят по 0,025 мл: в 1-2 ряды - цельной пробы, в 3-4 - разведение 1:3, в 5-6 - разведение 1:7 и делают последовательные двукратные разведения до 8 лунки (из 8 лунки 0,025 мл удаляют), получая разведения: в 1-2 рядах от 1:2 до 1:256, в 3-4 рядах - от 1:6 до 1:768, в 5-6 рядах - от 1:14 до 1:1792. В лунки всех рядов добавляют по 0,025 мл 50% взвеси формалинизированных эритроцитов барана, разведенных в 50 раз. Содержимое лунок перемешивают покачиванием пластин, оставляют на 15 мин при температуре °С и во все лунки закапывают по 0,05 мл сыворотки холерной О1 адсорбированной для РА в разведении 1:2. Пластины оставляют при температуре °С в течение 24 ч.

Постановка контроля формалинизированных эритроцитов барана. В контрольную лунку вносят 0,025 мл взвеси разведенных в 50 раз эритроцитов барана и добавляют 0,075 мл 0,9% раствора натрия хлорида.

Учет результатов РНГА. Результат считают положительным при наличии гемагглютинации (эритроциты выпадают на дно лунки равномерным слоем в виде "зонтика", занимая не менее 2/3 сферической поверхности лунки; в ряде случаев может наблюдаться фестончатое оплывание краев агглютината).

Результат считают отрицательным при отсутствии гемагглютинации (эритроциты выпадают на дно лунки в виде темно-коричневой полусферы или узкого колечка с ровным краем). В контрольных лунках результат должен быть отрицательным.

Последние лунки, в которых наблюдается положительная гемагглютинация учитывают как показатели титров в РНГА, определяющие разведения вакцины. Рассчитывают среднее арифметическое значение обратных показателей титров в РНГА трех разведений (в двух повторностях) и умножают на 10 (разведение таблетки). Обратная величина титра РНГА соответствует содержанию О-антигена штаммов V. cholerae О1 в условных единицах в 1 таблетке. Колебания результатов обратных показателей титров в РНГА в таблетках не должны превышать 5% от средней арифметической величины.

Иммуногенностъ. должна быть не более 1/20000 части таблетки. Для испытания используют 2 таблетки, которые растирают в стерильной ступке и добавляют 10 мл 0,9% раствора натрия хлорида (в 0,5 мл - 1/10 часть таблетки). Затем делают десятикратные последовательные разведения в 0,9% растворе натрия хлорида, получая в 0,5 мл от 1/100 до 1/1000 части таблетки. После чего делают последовательные пятикратные разведения в 0,9% растворе натрия хлорида, содержащие в 0,5 мл от 1/5000 до 1/125000 части таблетки. Таким образом получают четыре иммунизирующие дозы, содержащие 1/1000, 1/5000, 1/25000 и 1/125000 часть таблетки в объеме 0,5 мл каждая.

Каждую дозу вводят однократно внутрибрюшинно 16 беспородным белым мышам обоего пола массой  г в объеме 0,5 мл. Через сут по 8 иммунизированных животных заражают дозой 300 (допускается доза от 50 до 500 ) внутрибрюшинно взвесью 3-х-4-х часовых агаровых культур V. cholerae О1 биовара эльтор серовара Инаба и V. cholerae О1 биовара эльтор серовара Огава в объеме 0,5 мл.

Подготовка штаммов для заражения описана в частной фармакопейной статье. Для контроля берут по 10 белых мышей на каждый штамм для заражения, вводят им ту же дозу , что и иммунизированным животным.

Учет результатов. Наблюдение за животными ведут в течение 3 сут. В группах иммунизированных и заражённых животных для определения подсчитывают количество выживших. В группе зараженных белых мышей для определения 1 подсчитывают количество павших животных. В контрольной группе животных, зараженных 300 допустимо выживание от 1 до 3 белых мышей для каждого штамма.

По методу Кербера в модификации И.П. Ашмарина подсчитывают одного из заражающих штаммов будет выше допустимого значения, контроль повторяют на том же количестве животных. Если при повторном испытании величина вновь превысит допустимый предел, серию бракуют.

Если при расчете величины заражающей дозы будет установлено, что она содержит менее 50 или более 500 , контроль повторяют на том же количестве животных. Если в контрольной группе животных, зараженных 300 выживет более 3 белых мышей, контроль повторяют на том же количестве животных.

Маркировка и упаковка. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты (средства)".

Хранение. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты (средства)".