Государственный стандарт качества лекарственного средства. Фармакопейная статья "Сыворотки противоботулинические Типов А, В, Е Лошадиные"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Фармакопейная статья
"Сыворотки противоботулинические Типов А, В, Е Лошадиные"

Вводится впервые

Данная фармакопейная статья распространяется на иммунобиологические лекарственные средства, сыворотки противоботулинические типов А, В и Е, которые представляют собой иммуноглобулиновые фракции сыворотки крови лошадей, содержащие специфические антитела, нейтрализующие ботулинические токсины типов А, В или Е. Предназначены для профилактики и лечения ботулизма.

Производство

Сыворотки получают из плазмы крови лошадей, иммунизированных соответствующими ботулиническими токсинами/анатоксинами. Очищенную концентрированную иммуноглобулиновую фракцию плазмы крови лошади, содержащую антитела, нейтрализующие ботулинический токсин соответствующего типа, получают методами солевого фракционирования, ферментации, хроматографии, мембранной фильтрации.

Испытания

Описание. Прозрачная или слегка опалесцирующая, бесцветная или с желтоватым оттенком жидкость без осадка. Определение проводят визуально.

Подлинность. Сыворотка должна нейтрализовывать действие ботулинических токсинов типов А, В или Е. Определение проводят по разделу "Специфическая активность".

Прозрачность. Прозрачная или слегка опалесцирующая жидкость. Определение проводят в соответствии с ОФС "Прозрачность и степень мутности жидкостей", если нет других указаний в частной фармакопейной статье. Показатель оптической плотности сыворотки при длине волны 540 нм в кювете толщиной слоя 1 см не должен превышать 0,05.

Цветность. Бесцветная или с желтоватым оттенком жидкость. Определение проводят в соответствии с ОФС "Степень окраски жидкостей", если нет других указаний в частной фармакопейной статье. Показатель оптической плотности сыворотки при длине волны 400 нм в кювете толщиной слоя 1 см не должен превышать 0,15.

Механические включения. Видимые механические включения должны отсутствовать. Определение проводят в соответствии с ОФС "Видимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения и глазных лекарственных формах".

рН. От 6,8 до 7,2, если нет других указаний в частной фармакопейной статье. Определение проводят методом потенциометрического титрования в соответствии с ОФС "Ионометрия".

Содержание белка. От 8 до 12%, если нет других указаний в частной фармакопейной статье. Определение проводят колориметрическим методом с биуретовым реактивом в соответствии с ОФС "Определение белка".

Стерильность. Должна быть стерильной. Испытания проводят методами прямого посева или мембранной фильтрации в соответствии с ОФС "Стерильность", если нет других указаний в частной фармакопейной статье.

Пирогенность. Должна быть апирогенной. Определение проводят в соответствии с ОФС "Пирогенность", если нет других указаний в частной фармакопейной статье. Указывают допустимые пределы изменений температуры у животных, тест-дозу. Если не указано иначе, вводят 1 мл неразведенной сыворотки на 1 кг массы кролика.

Аномальная токсичность. Должна быть нетоксичной. Определение проводят в соответствии с ОФС "Аномальная токсичность". Пяти белым мышам препарат вводят по 1 мл внутрибрюшинно, двум морским свинкам вводят по 10 мл подкожно.

Специфическая активность. 1 мл противоботулинической сыворотки типа А должен содержать не менее 2500 Международных единиц (МЕ), противоботулинической сыворотки типа В не менее 600 МЕ, противоботулинической сыворотки типа Е не менее 1200 МЕ. Специфическую активность противоботулинических сывороток определяют в тесте нейтрализации токсина. (1 МЕ ботулинического антитоксина - это специфически нейтрализующая активность в отношении ботулинического токсина одноименного типа, которая содержится в определенном количестве международного стандартного образца, представляющего собой лиофилизированную лошадиную сыворотку).

Определение опытной дозы ботулинических токсинов (L+/5).

Опытная доза ботулинических токсинов типа А, В и Е представляет собой наименьшее количество токсина, которое в смеси с 0,2 ME антитоксической противоботулинической сыворотки одноименного типа при введении мышам вызывает гибель 50% животных на 4 сутки при явлениях ботулизма.

Для определения опытной дозы готовят несколько разведений ботулинического токсина, различающихся между собой на 10-20%.

При определении L+/5 токсина используют стандартный образец (СО) активности противоботулинической сыворотки соответствующего типа, калиброванный в МЕ, который разводят 0,9% раствором натрия хлорида с таким расчетом, чтобы в 1 мл раствора содержалась 1 ME (0,2 ME в 0,2 мл). 1 мл СО активности противоботулинической сыворотки смешивают с 1,5 мл раствора ботулинического токсина одноименного типа разной концентрации, начиная с наименьшей. Смеси токсина с сывороткой осторожно перемешивают, выдерживают при температуре °С на минут, затем вводят по 0,5 мл внутривенно 4 белым мышам. За животными наблюдают 4 суток, отмечая клинику заболевания. Отмечают то разведение токсина, которое в смеси со стандартным образцом вызвало гибель 50% животных при явлениях ботулизма.

Определение специфической активности противоботулинической сыворотки. Исходя из предполагаемой активности, сыворотку разводят 0,9% раствором натрия хлорида до концентрации 1 МЕ/мл. Готовят несколько разведений, отличающихся по активности одно от другого на 10-20%.

По 1 мл каждого разведения сыворотки переносят во флаконы, куда добавляют по 1,5 мл ботулинического токсина одноименного типа, содержащего 5 опытных доз. Полученные смеси осторожно перемешивают, избегая пенообразования и после выдерживания при температуре °С в течение мин вводят 4 белым мышам массой  г внутривенно в объеме 0,5 мл. За животными наблюдают 4 суток, отмечая клинику заболевания и число павших от ботулизма.

Опыт сопровождают контролем опытной дозы токсина, для чего готовят смесь, содержащую 1 мл стандартного образца с концентрацией 1 МЕ/мл и 1,5 мл токсина, содержащего 5 опытных доз. Смесь инкубируют при тех же условиях, что и испытуемую сыворотку и вводят ее внутривенно 4 белым мышам массой  г внутривенно в объеме 0,5 мл. За животными наблюдают 4 сут, отмечая клинику заболевания и число павших от ботулизма.

Специфическую активность (титр) сыворотки рассчитывают, исходя из наибольшего ее разведения, которое в смеси с опытной дозой токсина обеспечивает защиту 100% мышей от ботулизма. Тест не учитывают, если более 50% мышей контрольной группы остались живы.

Удельная активность. Не менее 2000 МЕ на 0,1 г белка для противоботулинической сыворотки типа А, 500 МЕ для противоботулинической сыворотки типа В, 1000 МЕ для противоботулинической сыворотки типа Е. Расчет удельной активности производят по формуле:

,

где Т - титр сыворотки, МЕ/мл

С - концентрация белка, г/мл

Сульфат-ионы. Не более 0,025%. Определение проводят колориметрическим методом.

Методика

К 1 мл испытуемого образца прибавляют 3,5 мл воды, 0,5 мл 5% раствора бария хлорида и перемешивают. Выдерживают 15 мин. Измеряют оптическую плотность суспензии при длине волны 540 нм в кювете с толщиной слоя 5 мм по сравнению с контрольным раствором, содержащим 1 мл испытуемого образца и 4 мл воды.

Расчет содержания сульфат-ионов проводят по калибровочному графику. Калибровочный график строят при каждом анализе.

Построение калибровочного графика

Готовят основной раствор калия сульфата. Перед определением основной раствор калия сульфата разводят водой в 10 раз. К 0,5 - 4,5 мл полученных с интервалом 0,5 мл растворов прибавляют воду до объема 4,5 мл (за исключением последнего разведения) и 0,5 мл 5% раствора бария хлорида, перемешивают. Полученные растворы содержат сульфат-ионы в концентрации от 10 до 90 мкг/мл. Проводят анализ, как указано выше. Строят график зависимости оптической плотности от концентрации сульфат-ионов (мкг/мл).

Примечание: приготовление основного раствора калия сульфата, содержащего 1 мг/мл сульфат-ионов: 1,8140 г калия сульфата, высушенного до постоянной массы при температуре 100-105°C, растворяют в воде в мерной колбе, вместимостью 1 л, и доводят объем раствора водой до метки, перемешивают.

Натрия хлорид. От 0,85 до 0,95%. Определение проводят в соответствии с ОФС "Определение хлоридов методом осадительного титрования".

Хлороформ. Не более 0,1%. Определение проводят колориметрическим методом, основанным на способности хлороформа образовывать с резорцином в щелочной среде соединение хиноидной структуры, которое дает цветную реакцию.

Методика

В пробирки вносят по 0,1 мл препарата, добавляют 0,9 мл 0,9% раствора натрия хлорида, 2 мл 20% раствора натрия гидроксида и 1 мл 10% раствора резорцина.

Параллельно с испытуемыми образцами препарата готовят аналогичную пробу с образцом сравнения - 0,1% раствором хлороформа.

Содержимое пробирок перемешивают и нагревают в кипящей водяной бане в течение 1 мин. Пробы осторожно охлаждают в холодной воде до температуры 15-18°С, затем измеряют оптическую плотность (Д) окрашенного раствора при длине волны 540 нм в кювете с толщиной слоя 5 мм по сравнению с контрольным раствором, состоящим из 1 мл воды и 2 мл 20% раствора натрия гидроксида. Раствор резорцина в контрольный раствор не добавляют, т.к. продукты его окисления окрашиваются в зеленый цвет.

Расчет содержания хлороформа проводят путем сравнения оптической плотности испытуемого образца и образца сравнения - 0,1% раствора хлороформа.

Содержание хлороформа в испытуемом образце (С, в%) вычисляют по формуле:

, где

- оптическая плотность испытуемого образца,

- оптическая плотность образца сравнения - 0,1% раствора хлороформа.

0,1 - количество испытуемого образца, взятого на анализ, мл

Примечание: приготовление 0,1% раствора хлороформа:

Хлороформ 0,1 мл

Вода до 100 мл

Раствор используют свежеприготовленным

Приготовление 10% раствора резорцина

Резорцин 5 г;

Вода до 50 мл

Раствор используют свежеприготовленным

Извлекаемый объем. Не менее номинального. Определение проводят в соответствии с ОФС "Извлекаемый объем лекарственных форм для парентерального применения".

Растворители и реагенты, выпускаемые в комплекте лекарственным средством.

В комплекте с сыворотками противоботулиническими типов А, В и Е лошадиными выпускается лошадиная сыворотка, разведенная 1:100, предназначенная для постановки внутрикожной пробы с целью выявления чувствительности человека к лекарственному средству, если это предусмотрено инструкцией по применению.

Упаковка и маркировка. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты (средства).

Транспортирование, хранение. Температура транспортирования и хранения должна находиться в пределах от 2 до 8°С, если в частной фармакопейной статье нет других указаний.