Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья ОФС "Споровые пробиотики для медицинского применения"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Общая фармакопейная статья ОФС
"Споровые пробиотики для медицинского применения"

Вводится впервые

Данная общая фармакопейная статья распространяется на группу лекарственных средств - споровые пробиотики для медицинского применения (далее по тексту "споровые пробиотики").

Споровые пробиотики представляют собой биомассу живых бактерий рода Bacillus лиофильно высушенную в защитной среде, либо их суспензию в 7% растворе натрия хлорида.

Споровые пробиотики по составу подразделяются:

- монокомпонентные - полученные, на основе одного производственного штамма бактерий рода Bacillus (например, B.subtilis 534 или B.cereus IP 5832);

- поликомпонентные - полученные, на основе нескольких производственных штаммов бактерий рода Bacillus, принадлежащих к разным видам (например, B.subtilis 3 и B.licheniformis 31), дополняющие или потенцирующие друг друга по ферментативным свойствам, антагонистической активности, продукции биологически активных веществ, механизму действия или другим свойствам.

Производственные штаммы бактерий рода Bacillus

Штаммы бактерий рода Bacillus используемые для производства споровых пробиотиков депонируют в официальных коллекциях (табл.1).

Таблица 1 - Производственные штаммы бактерий рода Bacillus, используемые в производстве споровых пробиотиков в РФ

Название производственного штамма бактерий рода Bacillus	Место депонирования, N депозита
B. subtilis 3	Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика, ВКПМ N В-2335
B.licheniformis 31	Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика, ВКПМ N В-2336
B.subtilis 534	Всероссийская коллекция микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им.Г.К. Скрябина РАН; ВКМ N 1666 Д
B.subtilis 3 Н	Государственная коллекция патогенных микроорганизмов, Россия (ГКПМ), N 248

Производственные штаммы бактерий рода Bacillus проверяют по культуральным, тинкториальным, морфологическим и биохимическим свойствам, безопасности (in vitro и in vivo), на отсутствие контаминации (табл.2-3). Определение проводят в соответствии с ОФС "Производственные штаммы и штаммы для контроля" и "Безопасность пробиотиков для медицинского применения в тестах in vivo".

Таблица 2 - Морфологические, тинкториальные и культуральные свойства производственных штаммов бактерий рода Bacillus

Название штамма	Описание морфологических и культуральных свойств
B. subtilis 3	Грамположительные аэробные спорообразующие палочки, размером 2,7х0,8 мкм, расположенные одиночно или в виде цепочек. Клетки подвижны, образуют аэробно споры овальной формы, которые располагаются в клетке центрально. При спорообразовании клетки не раздуваются. Не растет в анаэробных условиях. На питательной среде МПА или Гаузе N 2 после инкубации при температуре °С образует матовые складчатые колонии телесного цвета с изрезанными краями, легко снимающиеся петлей с агара. На мясо-пептонном бульоне (МПБ) или бульоне Хоттингера образует беловатую пленку, вызывая незначительное помутнение среды.
B.licheniformis 31	Грамположительные спорообразующие палочки, размером 2,5х0,6 мкм, располагаются перитрихиально, в основном в виде цепочек. Клетки подвижны, образуют споры овальной формы, которые располагаются в клетке центрально. При спорообразовании клетки не раздуваются. Растет в анаэробных условиях. На питательной среде МПА или Гаузе N 2 после инкубации при температуре °С в течение 24-48 ч образует гладкие круглые коричневатые колонии, тяжело снимающиеся петлей с агара. В мясо-пептонном бульоне (МПБ) образует придонный рост, вызывая помутнение среды.
B.subtilis 534	Грамположительные аэробные спорообразующие палочки, размером 2,8х0,7 мкм, расположенные одиночно или в виде цепочек. Клетки подвижны, образуют аэробно споры овальной формы, которые располагаются в клетке центрально. При спорообразовании клетки не раздуваются. Не растет в анаэробных условиях. На питательной среде МПА после инкубации при температуре °С в течение 24 ч образует белые шероховатые и гладкие колонии, легко снимающиеся петлей с агара, допустимо наличие до 50% гладких белых колоний. На мясо-пептонном бульоне (МПБ) или бульоне Хоттингера растет в виде беловатой пленки и слабого придонного осадка, вызывая незначительное помутнение среды.
B.subtilis 3 Н	Грамположительные аэробные спорообразующие палочки, размером 1,5-4,0х0,4-0,6 мкм, расположенные одиночно или в виде цепочек. Клетки подвижны, образуют аэробно споры овальной формы, которые располагаются в клетке центрально. При спорообразовании клетки не раздуваются. Не растет в анаэробных условиях. На питательной среде Гаузе N 2 или полусинтетической среде с дрожжевым диализатом после инкубации при температуре °С в течение 24 ч образует шероховатые с фестончатыми краями розовато-бежевые или коричневые колонии, легко снимающиеся петлей с агара, допустимо наличие до 20% гладких белых или прозрачных колоний. На мясо-пептонном бульоне (МПБ) образует беловатую пленку и слабый придонный осадок, вызывая незначительное помутнение среды.

Таблица 3 - Физиолого-биохимические свойства производственных штаммов бактерий рода Bacillus

Свойства	Штаммы бактерий рода Bacillus
	B. subtilis 3			B.licheniformis 31	B.subtilis 3 Н	B.subtilis 534
Ферментация
- глюкозы		+		+	+	+
- арабинозы		+		-	+	+
- ксилозы		+		+	+	+
- маннита		+		+	+	+
Образование кислоты и газа из глюкозы	-			-	-	-
Образование кислоты из глюкозы	+			+	+	+
Утилизация - цитрата			+	+	+	+
- пропионата			-	+	-	-
Гидролиз - крахмала			+	+	+	+
- мочевины			-	-	-	-
- казеина			+	+	+	+
- тирозина			-	-	-	-
Редукция нитратов	+			+	+	+
Образование газа из - в анаэробных условиях	-			+	-	-
Обесцвечивание метиленового синего	+			+	+	+
Каталаза	+			+	+	+
Реакция Фогес-Проскауэра	+			+	+	+
Аргининдегидролаза	-			+	+	-
Лецитиназа	-			-	-	-
Гиалуронидаза	-			-	-	-
Гемолитическая активность	-			-	-	-
Образование глобул поли--ксимасляной кислоты на глюкозном агаре	-			-	-	-
Лизоцимная активность	+			+	-	+
Рост при 50°С	+			+	+	+
Рост при 65°С	-			-	-	-
Рост в 7% NaCl	+			+	+	+
Устойчивость к воздействию желудочного сока	+			+	+	+
Устойчивость к воздействию желчи	+			+	+	+
Адгезивная активность	-			-	-	-
Антагонистическая активность (зоны задержки роста тест-штаммов в мм)	не менее 10-15			не менее 10-15	не менее 10-15	не менее 10-15

Таблица 4 - Изучение безвредности, вирулентности, токсичности и токсигенности штаммов бактерий рода Bacillus

N штамма	Безвредность		Вирулентность		Токсичность		Токсигенность
	Вводимая доза КОЕ/ 0,5 мл)	Кол-во живых/ павших мышей	Вводимая доза КОЕ/ 0,5 мл)	Кол-во живых/ павших мышей	Вводимая доза (х КОЕ/мл)	Кол-во живых/ павших мышей	Вводимая доза (мл)	Кол-во живых/ павших мышей
B. subtilis 3	0,1	10/0	0,5	10/0	0,5	10/0	0,5	10/0
	1	10/0	1	10/0	1,0	10/0	1,0	10/0
	10	10/0	10	10/0	2,0	10/0
B. licheniformis 31	0,1	10/0	0,5	10/0	0,5	10/0	0,5	10/0
	1	10/0	1	10/0	1,0	10/0
	10	10/0	10	10/0	2,0	10/0	1,0	10/0
B. subtilis 534	0,1	10/0	0,5	10/0	0,5	10/0	0,5	10/0
	1	10/0	1	10/0	1,0	10/0
	10	10/0	10	10/0	2,0	10/0	1,0	10/0
B. subtilis Н3	0,1	10/0	0,5	10/0	0,5	10/0	0,5	10/0
	1	10/0	1	10/0	1,0	10/0	1,0	10/0
	10	10/0	10	10/0	2,0	10/0

Производство

Производство споровых пробиотиков основано на выращивании/культивировании производственного штамма бактерий рода Bacillus на оптимальной питательной среде, в соответствующих условиях, методом поверхностного или глубинного культивирования с возможной лиофилизацией в защитной среде.

При производстве споровых пробиотиков проводят валидацию технологического процесса и методов контроля, которые в соответствии с принципами GMP, доказывают, что конкретная методика, процесс, оборудование, сырье, деятельность или система действительно приводят к ожидаемым результатам, и гарантируют, что лекарственное средство получено в соответствии со своим составом, не содержит посторонних контаминантов, маркировано надлежащим образом, упаковано и сохраняет свои свойства в течение всего срока годности.

При производстве споровых пробиотиков особое значение имеет постоянное выполнение на всех этапах производства внутрипроизводственного анализа основных показателей качества для оценки их воспроизводимости, анализа качества готовой продукции при выпуске и в течение всего срока хранения.

Споровые пробиотики для медицинского применения выпускают в следующих лекарственных формах:

- лиофилизат во флаконе,

- суспензии,

- таблетки

- капсулы.

Показатели качества лекарственного средства оценивают по соответствующей лекарственной форме (лиофилизата во флаконе, суспензии, таблеток и капсул).

Испытания

Показатели качества лекарственного средства лекарственной форме суспензии, таблетки и капсулы оценивают в соответствие с требованиями ОФС "Суспензии", "Таблетки" и "Капсулы".

Описание. Приводится описание физических свойств соответствующей лекарственной формы лекарственного средства.

Подлинность. Подлинность подтверждают методами - микроскопическим (окраской мазков по Граму или по Цилю-Нильсену), морфолого-культуральным (описание вида колоний выросших на адекватных питательных средах) и/или бактериологическим (подтверждается специфической активностью). Испытание проводят в соответствии с ОФС "Производственные штаммы и штаммы для контроля", если в частной фармакопейной статье не указаны другие требования.

Время растворения (для лиофилизатов). Указывают применяемый растворитель, его объем и, при необходимости, условия растворения (температуру растворителя, перемешивание, встряхивание) и время необходимое для растворения лекарственного препарата.

При проведении данного теста учитывают, что время растворения для лиофилизатов должно быть не более 5 мин.

Время распадаемости (для таблеток и капсул). Испытание проводят в соответствии с ОФС "Распадаемость таблеток и капсул".

Указывают применяемый растворитель, его объем и, при необходимости, условия растворения (температуру растворителя, перемешивание, встряхивание) и время необходимое для растворения лекарственного препарата. При проведении теста "Распадаемость" следует учитывать время распадаемости: для таблеток не должно превышать 15 мин, для капсул - 30 мин, если в частной фармакопейной статье не указаны другие требования.

рН. Испытание проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС "Ионометрия". Указывается допустимый интервал значений рН (в случае определения рН после растворения, следует указать растворитель и его объем).

Потеря в массе при высушивании. Определение проводят в соответствии с ОФС "Потеря в массе при высушивании".

Показатель потери в массе при высушивании должен составлять (если нет других указаний в частной фармакопейной статье) для:

- лиофилизатов - не более 3,5%;

- капсул - не более 3,5%;

- таблеток - не более 4,5%.

Средняя масса и отклонения от средней массы (для таблеток, содержимого капсул). Приводятся требования к средней массе и максимально допустимые отклонения от средней массы в соответствии с ОФС "Однородность массы дозированных лекарственных форм".

Извлекаемый объем (для суспензий). Определение проводят в соответствии с ОФС "Извлекаемый объем".

Специфическая безвредность. Определение проводят в соответствии с ОФС "Безопасность пробиотиков для медицинского применения". Указываются требования и критерии специфической безвредности; требования к животным, используемым для контроля; их количество; дозы, условия разведения и методы введения лекарственного средства; продолжительность наблюдения, учитываемые показатели. Лекарственное средство должен быть безвредным.

Отсутствие посторонних микроорганизмов и грибов. Определение посторонней контаминации испытуемого препарата проводят по методике приведенной ниже, либо в соответствии с ОФС "Микробиологическая чистота", методом прямого посева.

Лекарственные средства (лиофилизат во флаконе, суспензии) не должны содержать посторонних микроорганизмов.

Специфическая активность. Специфическая активность определяется количеством жизнеспособных бактерий в одной дозе лекарственного средства и антагонистической активностью по отношению к тест - штаммам. Определение проводят в соответствии с ОФС "Специфическая активность пробиотиков для медицинского применения".

В одной дозе препарата должно содержать не менее КОЕ.

Антагонистическая активность лекарственного средства в отношении штаммов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов определяется методом отсроченного антагонизма на среде Гаузе N 2 или полусинтетической среде с дрожжевым диализатом по зонам задержки роста тест-штаммов.

Зоны задержки роста тест-штаммов условно-патогенных и патогенных бактерий и грибов рода Candida должны быть не менее 10 мм.

Производственные штаммы и штаммы для контроля. Определение проводят в соответствии с ОФС "Производственные штаммы и штаммы для контроля".

В разделе должна содержаться информация:

1. Наименование производственных штаммов и штаммов для контроля, обоснование для включения в производство (депонирование в официальных коллекциях).

2. Производственные штаммы и штаммы для контроля должны быть проверены на отсутствие контаминации и соответствующим образом охарактеризованы по биологическим и биохимическим свойствам.

Упаковка и маркировка. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные средства".

Транспортирование и Хранение. Указывают условия транспортирования и хранения, обеспечивающие стабильность лекарственного средства. Пробиотики для медицинского применения транспортируются и хранятся при температуре от 2 до 8°С, если нет других указаний в частных фармакопейных статьях.