Государственный стандарт качества лекарственного средства. Фармакопейная статья ФС 42- "Вакцина туляремийная живая"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Фармакопейная статья ФС 42-
"Вакцина туляремийная живая"

Вводится впервые

Вакцина туляремийная живая, лиофилизат для приготовления суспензии для внутрикожного введения и накожного скарификационного нанесения представляет собой живую культуру вакцинного штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ, лиофилизированную в стабилизирующей среде. Вакцина предназначена для профилактики туляремии и обеспечивает развитие специфического иммунитета продолжительностью до 5 лет.

Особенности производства

Вакцинный штамм Francisella tularensis 15 НИИЭГ должен обладать типичными морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами; агглютинироваться сывороткой туляремийной диагностической до ее титра с образованием стойкого крупнохлопчатого агглютината; "остаточная вирулентность" вакцинного штамма для белых мышей массой  г должна находиться в пределах от до живых микробных клеток (м.к.); вакцинный штамм не должен вызывать гибели морской свинки при введении ей дозы равной  м.к; при накожной иммунизации морских свинок дозами  м.к. должен вызывать появление инфильтрата и гиперемии диаметром от 5 до 15 мм; при определении иммуногенности показатель вакцинного штамма для морских свинок должен быть не более 1000 микробных клеток.

Перед приготовлением производственной культуры вакцинного штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ проводят его пассаж через организм морской свинки с последующим отбором типичных иммуногенных (белых) колоний, выросших на плотной питательной среде при посеве селезенки и регионарных лимфатических узлов.

Технология производства вакцины предусматривает получение посевных культур I, II и III генерации штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, процесса накопления биомассы, необходимой для приготовления микробной взвеси определенной концентрации, последующим розливом, замораживанием, сублимационным высушиванием, герметизацией и упаковкой препарата. На стадиях приготовления посевных культур определяют рН, концентрацию микробных клеток, отсутствие посторонней микрофлоры.

В качестве стабилизаторов используются вещества, разрешенные к медицинскому применению: сахароза, натрия глютамат, тиомочевина, желатин.

Испытание готового продукта.

Описание. Пористая масса белого c желтоватым оттенком цвета

Подлинность. Должна содержать чистую культуру вакцинного штамма туляремийного микроба. Определение проводят иммунофлуоресцентным методом с использованием иммуноглобулинов флуоресцирующих туляремийных сухих в соответствии с инструкцией по применению. В мазках из препарата должно наблюдаться специфическое ярко-зеленое свечение по периферии микробных клеток.

Время растворения. Должна полностью растворяться в течение 3 мин при добавлении 1 мл воды для инъекций при встряхивании. Растворенный препарат - гомогенная мутная суспензия белого с желтоватым оттенком цвета без посторонних примесей, осадка или хлопьев. Определяют визуально.

Время седиментационной устойчивости. Суспензия должна оседать в течение 5 мин.

Размер частиц. Суспензия должна свободно проходить в шприц через иглу N 0840. Определение проводят в соответствие с ОФС "Инъекционные лекарственные формы".

рН. От 6,8 до 7,3. Определяют потенциометрически в соответствии с ОФС "Ионометрия". Для испытания используют 20 ампул, содержимое каждой ампулы растворяют в 1 мл воды для инъекций.

Потеря в массе при высушивании. Не более 4%. Определение проводят в соответствии с требованиями ОФС "Потеря в массе при высушивании". Для испытания используют 6 образцов.

Средняя масса и отклонение от средней массы. Коэффициент вариации массы вакцины в ампулах должен быть не более 5%. Определение проводят весовым методом. 10 образцов без этикеток обрабатывают смесью спирта с эфиром и помещают в эксикатор на 3 ч. Ампулы вскрывают, взвешивают вместе с препаратом, затем удаляют содержимое и промывают водой. После этого ампулы выдерживают в сушильном шкафу при температуре 100-105 С до постоянной массы. По разности масс ампул с содержимым и без него находят массу вещества и рассчитывают коэффициент вариации (V) в процентах по формуле:

, где

S - стандартное отклонение;

- среднее арифметическое значение массы вещества в ампуле;

X - масса вещества в каждой ампуле;

n - число ампул.

Отсутствие посторонних микроорганизмов и грибов. Вакцина не должна содержать посторонних микроорганизмов и грибов. Вакцина должна представлять чистую живую культуру вакцинного штамма туляремийного микроба. Определение проводят в соответствии с ОФС "Стерильность" с использованием тиогликолевой среды.

За один образец принимают содержимое 2 ампул препарата. В ампулы вносят по 1 мл 0,9% раствора натрия хлорида, перемешивают и по 1 мл каждого образца высевают в 2 пробирки, содержащие по 20 мл тиогликолевой среды. Одну пробирку из каждого образца инкубируют при температуре от 30 до 35°С для выявления аэробных и анаэробных микроорганизмов, а другую - при температуре от 20 до 25°С для выявления грибов. Через 5-7 сут из каждой пробирки производят пересев по 0,5 мл на 2 пробирки, содержащие по 10 мл тиогликолевой среды и инкубируют при указанных выше температурах. Через 14 сут выращивания со дня первичного посева из всех пробирок делают мазки, окрашивают их по Граму, просматривают под микроскопом при увеличении К7х40.

В случае обнаружения хотя бы в одном из 10 просмотренных полей зрения кокков или грамположительных палочек, препарат считается загрязненным посторонней микрофлорой.

При выявлении в мазках грамотрицательных палочек, отличающихся по морфологии от туляремийного микроба из этого образца готовят три мазка, которые окрашивают иммуноглобулинами флуоресцирующими туляремийными сухими и просматривают в каждом мазке не менее 10 полей зрения под фазовоконтрастным и люминесцентным микроскопами. Если не все микробные клетки, обнаруживаемые под фазовым контрастом, окрашиваются специфически (ярко-зеленое свечение по периферии клеток) препарат считают не выдержавшим испытание.

Специфическая безопасность. Вакцина должна быть безопасной и не вызывать гибель более одной морской свинки из трех.

Вакцина, введенная подкожно в дозе  м.к. по ОСО мутности 42-28-85П (10 МЕ) соответствующего года выпуска, что эквивалентно  м. к./мл туляремийного микроба, трем морским свинкам массой (475_25) г в объеме 1 мл, не должна вызывать гибели животных в течение 15 сут наблюдения. В месте введения возможен некроз тканей кожи и подкожной клетчатки.

В случае если животные остаются живыми или наступает гибель одной морской свинки, препарат считают безопасным. В случае гибели двух и более животных испытание повторяют на удвоенном количестве. Если при повторном контроле наблюдается аналогичная гибель животных, препарат считают не выдержавшим испытание.

Специфическая активность.

1. Концентрация микробных клеток.

В препарате должно содержаться  м.к. в 1 мл. Колебания результатов определений в образцах указаны в частной фармакопейной статье. Определяют в трех образцах (для каждого объединяют содержимое двух первичных упаковок). В 2 первичные упаковки с вакциной вносят по 1,0 мл 0,9% раствора натрия хлорида рН 7,0-7,2 и после получения гомогенной суспензии объединяют содержимое упаковок. Из каждого образца 0,5 мл суспензии используют для определения концентрации микробных клеток в 1 мл вакцины. Для этого по 0,5 мл каждого образца вакцины вносят в отдельные стандартные пробирки и добавляют 0,9% раствор натрия хлорида до достижения ОСО мутности 42-28-85П (10 МЕ) соответствующего года выпуска. Концентрацию микробных клеток определяют по формуле:

, где:

К - концентрация микробных клеток;

V - объём добавленного 0,9% раствора натрия хлорида, использованного для разведения, мл;

0,5 - объём вакцины, мл.

 м.к./мл - эквивалент туляремийного микроба по ОСО мутности 42-28-85П (10 МЕ) соответствующего года выпуска. 

2. Количество живых микробных клеток.

Количество живых микробных клеток должно составлять не менее 40% от общего количества микробных клеток. Колебания результатов определений в образцах серии не должны превышать 20% от средней арифметической величины.

При определении содержания живых микробных клеток в вакцине используют концевые химически чистые пипетки и пробирки с 0,9% раствором натрия хлорида, которые должны быть охлаждены до температуры °С.

Для определения количества живых микробных клеток из приготовленных ранее образцов взвесей вакцины делают последовательные десятикратные разведения от (к 0,5 мл вакцины добавляют 4,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида) до , используя для каждого разведения отдельную пипетку вместимостью 1 мл. Из разведения по 0,1 мл взвеси раздельно для каждого образца высевают на 3 чашки Петри с рыбно-дрожжевым питательным агаром или FT-агаром.

Учет результатов определения количества живых клеток в вакцине проводят через 5 сут выдерживания посевов при температуре °С.

За количество живых микробных клеток принимают среднюю арифметическую определений количества живых микробных клеток в трех образцах. Полученную величину умножают на степень разведения культуры () и увеличивают в 10 раз (для контроля используют 0,1 мл вакцины) получая количество живых туляремийных микробов, содержащихся в 1 мл вакцины.

Процент живых микробных клеток вычисляют по формуле:

, где

БК - количество живых м.к. в 1 мл;

ОК - общая концентрация м.к.

3. Степень диссоциации. Число SR (белых) иммуногенных колоний должно составлять не менее 80% от общего количества выросших колоний.

Количество колоний определяют на тех же чашках Петри с посевами, на которых определяют содержание живых микробных клеток. После инкубации чашек Петри в термостате при температуре °С в течение 5 сут их дополнительно помещают на 24 ч в холодильник при температуре °С. После этого подсчитывают число иммуногенных "белых" и неиммуногенных "серых" колоний и вычисляют их процентное соотношение.

Исходя из количества жизнеспособных микробных клеток в ампуле с вакциной рассчитывают количество доз и объем растворителя каждой серии для приготовления суспензии для инъекций, накожного скарификационного нанесения и ингаляций.

Количество накожных доз. В ампуле должно содержаться от 15 до 50 накожных доз. Количество прививочных доз в ампуле устанавливается путем деления количества живых м.к. на  м.к., составляющих одну прививочную дозу.

Иммуногенность. Не менее 8 из 10 морских свинок, привитых накожно дозой живых м.к. в объеме 0,1 мл, должны быть предохранены от гибели при подкожном заражении 1000 Dosis certe letalis (DCL) вирулентного штамма туляремийного микроба голарктической расы, 1 DCL которого не должна превышать 5 м.к.

10 морских свинок массой  г иммунизируют дозой живых м.к. в объеме 0,1 мл накожно, как при определении прививаемости.

Заражение животных проводят через 25-30 сут после иммунизации дозой, равной 1000 DCL. 3 неиммунизированных (контрольных) животных заражают 1 DCL . Наблюдение за зараженными животными ведут в течение 30 сут.

Все контрольные животные должны погибнуть от туляремии в срок до 15 сут. У них должны наблюдаться типичные патологоанатомические изменения (плотный инфильтрат на месте введения, гиперемия сосудов подкожной клетчатки и паховых лимфатических узлов, увеличение и уплотнение селезенки и печени). Всех павших животных вскрывают, органы и ткани высевают методом отпечатков на чашки Петри с рыбно-дрожжевым или FT-агаром с добавлением 5% крови.

В случае гибели более 2 свинок из 10 вакцинированных и зараженных, испытание повторяют по той же методике в сравнении со стандартным образцом вакцины туляремийной живой сухой.

Если при повторном контроле погибли более 2 свинок из 10 вакцинированных и зараженных, а для стандартного образца эти показатели остались в пределах нормы - данную серию считают не выдержавшим испытание.

Прививаемость. При накожной иммунизации морских свинок дозой живых м.к. в объеме 0,1 мл у всех животных через 2-5 сут вокруг насечек должны образоваться инфильтрат и гиперемия диаметром от 5 до 15 мм.

В ампулу вносят воду для инъекций из расчета 0,1 мл на 1 накожную дозу. Полученную микробную взвесь разводят 0,9% раствором натрия хлорида в 10 раз до концентрации живых м.к. в 1 мл и прививают накожно в объеме 0,1 мл трех морских свинок массой г. На участок депилированной кожи, предварительно обработанной спиртом и эфиром, после испарения эфира наносят пипеткой 2 капли микробной взвеси на расстоянии 20-30 мм одну за другой. Через каждую каплю оспопрививательным пером делают по две параллельные некровоточащие насечки длиной 8-12 мм. Нанесенную на кожу взвесь тщательно втирают в течение 1 мин плоской стороной пера.

Если препарат не выдерживает испытание, контроль повторяют по той же методике на удвоенном количестве животных.

Термостабильность. Показатель термостабильности должен быть не менее 7 сут. Определение проводят через 14 сут хранения 6 ампул при температуре °С.

Методика определения количества живых микробных клеток изложена в разделе "Специфическая активность", "Процент живых клеток".

Показатель термостабильности рассчитывают по формуле:

, где:

где

t - показатель термостабильности в сут;

- логарифм первоначального числа живых м.к./мл;

- логарифм числа живых м.к./мл через 14 сут хранения вакцины при температуре °С;

0,3 - постоянная величина;

14 - срок хранения вакцины при температуре °С в сут.

Растворители, выпускаемые в комплекте с вакциной. В комплекте с вакциной выпускается вода для инъекций в ампулах по 5 мл.

Маркировка и упаковка. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты (средства)".

Хранение. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты (средства)".