Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья ОФС "Биологические методы испытания препаратов интерферона с использованием культур клеток

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Общая фармакопейная статья ОФС
"Биологические методы испытания препаратов интерферона с использованием культур клеток

Вводится впервые

Настоящая фармакопейная статья определяет основные требования к биологическим методам испытаний препаратов интерферона с использованием клеточных культур и распространяется на субстанции и лекарственные формы интерферона человеческого всех типов природного и генно-инженерного происхождения.

Общие положения

Биологические методы с использованием клеточных культур применяют для определения следующих показателей качества препаратов интерферона:

1. Подлинность

2. Специфическая активность

3. Токсичность (для интерферона альфа-типа).

Методы определения подлинности и специфической активности основаны на способности интерферона подавлять цитопатическое действие вируса на клеточную культуру. При проведении испытаний используют клетки, чувствительные к данному типу интерферона и к вирусу-индикатору. Выбор комбинации "клеточная культура/вирус" основывается на том, какая из них обеспечивает наиболее чувствительный ответ для данного типа интерферона в сравнении со стандартным образцом (СО). Наиболее часто используются следующие комбинации клетка/вирус: клетки бычьих почек Madin-Darby (MDBK), лимфоидные клетки человека Л-41, диплоидные клетки человека Л-68 /вирус везикулярного стоматита (VSV); клетки линии Vero, Нер2С, L929, Л-41/вирус энцефаломиокардита мышей (EMCV); клетки фибробластов человека/вирус леса Семлики, вирус Синдбис.

Подготовка к испытаниям.

Клетки. Культуру клеток выращивают способом, предусмотренным для данного вида клеток в частной фармакопейной статье, таким образом, чтобы обеспечить образование полноценного монослоя в лунках культуральных планшетов в количестве, необходимом для проведения анализа.

Образцы препарата. Пробоподготовка используемых образцов для анализа производится в соответствии с указаниями, приведенными в частных фармакопейных статьях на конкретный препарат.

Приготовление суспензии индикаторного вируса. Суспензию индикаторного вируса готовят в соответствии с указаниями частной фармакопейной статьи на препарат.

Раздел 1. Подлинность

Подлинность препаратов интерферона определяют путем нейтрализации противовирусной активности испытуемого препарата (ИП) стандартным образцом анти-интерферонового иммуноглобулина (IgG) или анти-интерфероновыми поликлональными антителами, предусмотренными в нормативной документации (НД) на соответствующий препарат. Реакцию нейтрализации противовирусной активности ИП проводят в культуре клеток, чувствительных к данному типу интерферона, в присутствии индикаторного вируса.

Порядок определения подлинности

Для определения подлинности препаратов интерферона используют монослой культур клеток, чувствительных к исследуемому типу интерферона, полученного при температуре °С в атмосфере с % в 96-луночных культуральных планшетах, при конечной концентрации клеток 25000-30 000 кл/лунку.

Готовят разведения стандарта анти-интерферонового иммуноглобулина или анти-интерфероновых поликлональных антител, рабочую дозу ИП и стандарта для определения активности интерферона (СО).

Испытуемый препарат и стандартный образец интерферона разводят таким образом, чтобы конечное разведение содержало 10 ед. противовирусной активности интерферона (без перевода в МЕ).

Готовят двукратные разведения стандарта анти-интерфероновых иммуноглобулинов или анти-интерфероновых поликлональных антител до концентраций, указанных в частных фармакопейных статьях на конкретные препараты.

Объединяют в пробирках равные объемы (по 0,5 мл) соответствующих разведений анти-интерферонового иммуноглобулина (анти-интерфероновых поликлональных антител) с рабочей дозой испытуемого препарата и СО. Инкубируют полученные смеси при температуре °С в течение 1 ч. Из лунок микропанелей с культурой клеток выливают ростовую питательную среду, в лунки вносят по 0,1 мл нейтрализованной смеси, не менее чем по 4 лунки на каждое разведение анти-интерферонового иммуноглобулина (анти-интерфероновых поликлональных антител).

Для оценки качества монослоя клеток в процессе постановки реакции (контроль) оставляют не менее 4 лунок, в которые не вносят нейтрализованную смесь. В этих лунках заменяют ростовую питательную среду на поддерживающую, которая должна обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетках вируса. В качестве поддерживающей среды обычно используют питательную среду без сыворотки плодов коров с добавлением антибиотиков.

Для контроля дозы индикаторного вируса оставляют 16 лунок в микропанели с культурой клеток, предварительно заменив в этих лунках ростовую питательную среду на поддерживающую.

Проверяют дозу вируса-индикатора и активность стандартного образца интерферона как описано в разделе 2 "Специфическая активность".

После внесения индикаторного вируса в лунки микропанелей с культурой клетки инкубируют при температуре °С в атмосфере с % до появления первых признаков цитопатических изменений в клетках с индикаторным вирусом в дозе 1   мл (обычно в течение 48 ч). Монослой в лунках с 0,1  мл индикаторного вируса должен соответствовать состоянию клеток в контрольных лунках.

Учет и интерпретация результатов.

Учёт результатов осуществляют при условии, что доза внесённого вируса соответствует 100  мл и при отсутствии признаков дегенерации в контрольной культуре клеток.

Нейтрализация активности испытуемого образца анти-интерфероновым иммуноглобулином (поликлональными антителами) в сравнении с МСО/СО, свидетельствует о том, что в испытуемом образце содержится интерферон соответствующего типа.

Раздел 2. Специфическая активность

Определение специфической активности является основным методом количественной оценки качества препаратов интерферона.

Активность интерферона определяют путем сравнения протективного действия испытуемого препарата (ИП) с аналогичным действием международного стандартного образца (МСО) или соответствующего стандартного образца (СО), откалиброванного в Международных единицах (МЕ) по соответствующему международному стандарту.

Метод испытан в трех международных исследованиях под эгидой Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) на международных стандартах всех типов человеческого интерферона (альфа, бета, гамма) и продемонстрировал чувствительность, надежность и воспроизводимость.

Проведение испытания

Определение специфической активности препаратов интерферона проводят на монослое культур клеток, чувствительных к исследуемому типу интерферона, полученном при температуре °С в атмосфере с % в 96-луночных культуральных планшетах. Плотность клеточной культуры при этом составляет 25000-30000 клеток в каждой лунке.

Противовирусную активность определяют в сравнении с МСО/СО активности человеческого лейкоцитарного интерферона для препаратов природного происхождения и в сравнении с МСО/СО активности человеческого рекомбинантного интерферона для генно-инженерных препаратов соответственно.

Готовят серию десятикратных и двукратных разведений исследуемого препарата в поддерживающей среде (на 4 разведения выше и ниже предполагаемого титра активности). Параллельно готовят соответствующие разведения стандартного образца.

Из лунок планшетов с клеточным монослоем удаляют ростовую среду и вносят приготовленные разведения испытуемого препарата и стандарта (по 100 мкл), используя на каждое разведение не менее 4 лунок с культурой клеток. Для контроля дозы индикаторного вируса оставляют 16 лунок с культурой клеток, а для контроля состояния монослоя клеток - 4 лунки. В эти 20 лунок вносят по 100 мкл поддерживающей среды, используемой для приготовления разведений испытуемых препаратов. Инокулированные и контрольные культуры клеток инкубируют в течение 24 ч при температуре °С в атмосфере с % . Затем в каждую лунку с испытуемым материалом и стандартом вносят по 100 мкл вирусной суспензии, содержащей рассчитанную заранее дозу индикаторного вируса - 100 . В лунки контроля клеток вносят такой же объем (100 мкл) поддерживающей среды.

Определение дозы вируса-индикатора

Определение дозы индикаторного вируса начинают с установления его активности.

Для определения активности вируса-индикатора готовят десятикратные разведения вируса в поддерживающей среде в лунках 24-луночного планшета. Из лунок культурального планшета удаляют ростовую среду и вносят по 100 мкл приготовленных разведений вируса не менее чем по 6 лунок на каждое разведение. Инокулированные и контрольные культуры клеток инкубируют в течение 24 ч при температуре °С в атмосфере с % . За титр (активность) вируса принимают величину, обратную разведению препарата, при котором клеточная культура в 50% лунок оказалась полностью пораженной цитопатическим действием. Титр вируса выражают в тканевых цитопатических дозах - .

Активность вируса вычисляют методом Спирмена-Кербера по формуле:

где - lg разведения ниже которого произошла 100% гибель клеток (+)

d - lg интервала между разведениями (1,0)

n - число лунок на каждую дозу (4)

р - число лунок, давших гибель (+) в и последующих разведениях.

После установления активности вируса производят подсчёт дозы для последующего внесения в лунки с испытуемым препаратом.

Одновременно с внесением вируса-индикатора осуществляется контроль взятой дозы вируса на 16 лунках с культурой клеток, предназначенных для этих целей (по 4 лунки на каждое разведение вируса).

Вносят вирус по 100 мкл, начиная с разведения, соответствующего 100  мл, и до разведения, соответствующего 0,1  мл с коэффициентом разведения равным 10.

Лунки с культурой клеток для оценки состояния монослоя клеток остаются интактными.

После внесения индикаторного вируса культуру клеток инкубируют при температуре °С в атмосфере с % до появления первых признаков цитопатических изменений в клетках с индикаторным вирусом в дозе 1  мл. Монослой в лунках с 0,1  мл индикаторного вируса должен соответствовать состоянию клеток в контрольных лукнах.

Учёт активности интерферона осуществляют при условии, что доза внесённого вируса соответствует 100  мл; в лунках с клетками, зараженными индикаторным вирусом, наблюдается практически полный цитопатический эффект (80-100%), а в контрольной культуре клеток отсутствуют признаки дегенерации.

За титр интерферона принимают величину, обратную разведению препарата, при котором клеточная культура в 50% лунок полностью защищена от цитопатического действия вируса.

Титр интерферона вычисляют методом Спирмена-Кербера по формуле:

где - разведения ниже которого произошла 100% защита (-)

d - интервала между разведениями (1,0)

n - число лунок на каждую дозу (4)

р - число лунок, давших защиту (-) в и последующих разведениях.

Противовирусную активность интерферона в МЕ/мл вычисляют по формуле:

- противовирусная активность интерферона в исследуемом образце в МЕ/мл

- противовирусную активность СО интерферона в МЕ/мл

- титр исследуемого образца

- титр СО в данном опыте

Возможен инструментальный учет результатов с использованием селективного окрашивания живых клеток, защищенных интерфероном от действия вируса, элюирования красителя, фотометрирования оптической плотности элюата и последующей компьютерной обработки результатов. Описание инструментального метода приводят в частных фармакопейных статьях.

Раздел 3. Токсичность

Для определения токсичности препаратов интерферона альфа-типа на клеточных культурах используют монослойные перевиваемые или диплоидные клетки, чувствительные к данному типу интерферона и применяемые для определения его специфической активности (см. раздел "Общие положения"). Клетки выращивают способом, указанным в соответствующей ФСП на препарат (так же, как и для определения специфической активности). В лунки с 1-3- суточным монослоем вносят по 0,1 мл препарата в разведении, указанном для каждого конкретного препарата в частной фармакопейной статье. В лунки с контрольной культурой вносят поддерживающую среду без препарата. Культуры выдерживают в течение 24-48 ч при температуре °С в атмосфере с % , после чего просматривают под микроскопом. Клеточный монослой должен оставаться неповрежденным, без признаков дегенерации и не отличаться от контрольных проб.