Государственный стандарт качества лекарственного средства. Фармакопейная статья ФС 42- "Вакцина менингококковая серогруппы А полисахаридная сухая"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Фармакопейная статья ФС 42-
"Вакцина менингококковая серогруппы А полисахаридная сухая"

Водится впервые

Данная фармакопейная статья распространяется на вакцину менингококковую серогруппы А полисахаридную сухую, представляющую собой лиофилизированное лекарственное средство очищенного капсульного полисахарида группы А, полученного из штамма Neisseria meningitides серогруппы А. Технология получения менингококковой серогруппы А полисахаридной вакцины предусматривает культивирование штамма-продуцента в жидкой питательной среде Франца с последующим выделением из полученной биомассы полисахарида менингококка серогруппы А и его очисткой. Полисахарид Neisseria meningitides серогруппы А состоит из частично О-ацетилированных повторяющихся фрагментов N-ацетилманозамина, связанных фосфодиэфирными связями.

Производство

Процесс культивирования производственного штамма Neisseria meningitides должен осуществляться на плотных питательных средах, не содержащих элементов крови или элементов животного происхождения. Весь производственный процесс, основанный на использовании системы посевного материала и обеспечивающий стабильное получение вакцины для профилактики менингококковой инфекции серогруппы А с требуемой иммуногенностью и безопасностью для человека должен быть валидирован.

Посевной материал. Штамм-продуцент Neisseria meningitides должен быть охарактеризован по источнику его выделения и способности продуцировать полисахарид серогруппы А. Производственный штамм Neisseria meningitides серогруппы А должен обладать следующими свойствами:

- колонии штамма-продуцента, выращенные на питательном агаре с добавлением 20% сыворотки крупного рогатого скота, должны быть круглыми, гладкими, прозрачными, бесцветными, блестящими, с ровными краями, слегка выпуклыми, мягкими по консистенции, легко снимающиеся с агаровой поверхности. Диаметр колоний должен быть от 0,5 до 2,0 мм. В косопроходящем свете колонии должны иметь ярко-оранжевую окраску с радужным свечением;

- в мазках, окрашенных по Граму, должны присутствовать Грам-отрицательные диплококки, расположенные парами в виде "кофейных зерен", а также тетрадами или скоплениями;

- культура тест-штамма должна быть оксидазоположительна;

- культура тест-штамма должна разлагать глюкозу и мальтозу c образованием уксусной кислоты и не должна разлагать лактозу, сахарозу и фруктозу;

- суспензия культуры тест-штамма должна вступать в реакцию агглютинации только с гомологичной сывороткой серогруппы А и не агглютинироваться с гетерологичными сыворотками других серогрупп, а также не давать спонтанную реакцию агглютинации в 0,9% растворе натрия хлорида.

Бактериологическая чистота штамма-продуцента должна быть подтверждена путем посева на чувствительные питательные среды, исследованием морфологии колоний, микроскопией мазков, окрашенных по Граму, а также постановкой реакции агглютинации с гомо- и гетерологичными сыворотками.

На этапе культивирования производственного штамма с целью получения конечного объема биомассы используют жидкую полусинтетическую среду, не содержащую субстанций, которые могут осаждаться цетилтриметиламмонием бромистым, а также не содержащую элементов крови или высокомолекулярных полисахаридов.

Бактериологическая чистота полученной биомассы должна оцениваться и подтверждаться методами, применяемыми для оценки чистоты штамма-продуцента. Бактериальный сбор центрифугируют и осаждают полисахарид из надосадочной жидкости добавлением цетилтриметиламмония бромистого до его конечной концентрации 0,01%, после чего следует экстракция полисахарида из цетавлон-полисахаридного комплекса раствором кальция хлорида. Полученный полисахарид хранят при температуре минус 20°С.

Субстанцией полисахаридной менингококковой вакцины группы А является полисахарид, очищенный от нуклеиновых кислот, белка и липополисахарида путем ступенчатого фракционирования этанолом и экстракцией фенолом. Очищенную субстанцию высушивают в эксикаторе до постоянной массы над прокаленным кальция хлоридом и хранят при минус температуре 20°С.

Испытания готового продукта

Вакцина менингококковая серогруппы А полисахаридная сухая должна соответствовать следующим требованиям:

Описание. Аморфная масса в форме таблетки или рыхлого порошка от белого до беловато-серого цвета. Восстановленный препарат: бесцветный или желтоватого цвета раствор. Определение проводят визуально.

Подлинность. Вакцина должна тормозить реакцию пассивной гемагглютинации (РТПГА) в гомологичной "А" системе в концентрации не превышающей 0,4 мкг полисахарида в 1 мл при отсутствии тормозящего эффекта в гетерологичной "С" системе с содержанием полисахарида 50 мкг в 1 мл. Ингредиенты для проведения РТПГА:

- исследуемый раствор вакцины, содержащий 50,0 мкг полисахарида серогруппы А в 1 мл;

- набор реагентов "Диагностикумы эритроцитарные менингококковые серогрупп А и С, жидкие";

- 0,9% раствор натрия хлорида.

Определение рабочего разведения менингококковых диагностических сывороток. Для приготовления рабочего разведения менингококковых диагностических сывороток определяют их специфический титр в реакции пассивной гемагглютинации с диагностикумами эритроцитарными менингококковыми серогрупп А и С. Для постановки РТПГА используют круглодонный планшет для иммунологических реакций однократного применения. В два ряда лунок, начиная со второй, вносят по 50 мкл 0,9% раствора натрия хлорида. В первые лунки вносят по 100 мкл менингококковых сывороток серогрупп А и С, разведенных 1:10 0,9% раствором натрия хлорида. Далее готовят двукратные последовательные разведения каждой сыворотки, перенося из лунки в лунку по 50 мкл сыворотки. Из последней лунки 50 мкл разведения сыворотки удаляют. Затем в каждую лунку прибавляют по 0,25 мкл эритроцитарного диагностикума, гомологичного сыворотке. В четыре лунки (контроль отсутствия спонтанной агглютинации диагностикума) вносят по 0,5 мкл 0,9% раствора натрия хлорида. В две лунки добавляют по 0,25 мкл диагностикума серогруппы А, а в две другие - по 0,25 мкл диагностикума серогруппы С. После перемешивания ингредиентов путем покачивания пластины, ее помещают в термостат при температуре от 36 до 38°С на 2 - 2,5 ч, после чего проводят учет результатов. Последнее разведение сывороток, в котором наблюдается агглютинация почти всех эритроцитов с малозаметным кольцом из осевших неагглютинированных эритроцитов, является титром сыворотки и содержит 1 гемагглютинирующую единицу (ГАЕ). Предыдущее разведение содержит 2 ГАЕ и используется в качестве рабочего разведения сыворотки.

В контрольных лунках агглютинация должна полностью отсутствовать, а эритроциты выпадать на дно лунки в виде полусфер.

Проведение РТПГА. В первые лунки двух рядов планшета для иммунологических реакций вносят по 50 мкл испытуемого раствора вакцины менингококковой серогруппы А в исходной концентрации 50 мкг в 1 мл. В остальные лунки вносят по 25 мкл 0,9% раствора натрия хлорида. Затем исходные растворы вакцины титруют путем двукратных разведений в объеме 25 мкл до 12-ой лунки включительно; из последней лунки 50 мкл удаляют. В каждую лунку первого ряда добавляют по 25 мкл рабочего разведения гомологичной сыворотки. В каждую лунку второго ряда добавляют по 25 мкл гетерологичной сыворотки. После 15-20 минутной экспозиции при температуре от 18 до 22°С в каждую лунку добавляют по 25 мкл эритроцитарного диагностикума, гомологичного добавленной сыворотке. Таким образом, в 1 ряду реагирующая смесь будет состоять из гомологичных вакцине сыворотки и эритроцитов, во втором ряду - из вакцины и гетерологичных ей сыворотки и эритроцитов. Реакцию учитывают после 1,5 - 2 ч инкубирования в термостате при температуре от 36 до 38°С. После окончания инкубации отмечают минимальную концентрацию вакцины, которая подавляет агглютинацию эритроцитов. Специфичность вакцины подтверждается, если задержка гемагглютинации наблюдается только в гомологичной системе.

Контролями являются отсутствие спонтанной агглютинации и проверка правильности выбранного рабочего разведения сыворотки.

Время растворения. Содержимое ампулы должно полностью раствориться в 2,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида в течение 1 мин, при встряхивании.

Прозрачность восстановленного раствора. Восстановленная вакцина должна выдерживать сравнение с эталоном I. Определение проводят в соответствии с ОФС "Прозрачность и степень мутности жидкостей". Содержимое 4 ампул растворяют в 10 мл 0,9% раствора натрия хлорида.

Цветность восстановленного раствора. Восстановленная вакцина должна выдерживать сравнение с эталоном . Определение проводят в соответствии с ОФС "Степень окраски жидкостей". Содержимое 4 ампул растворяют в 10 мл 0,9% раствора натрия хлорида.

Механические включения. Восстановленная вакцина не должна содержать видимых механических включений. Определение проводят в соответствии с ОФС "Видимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения и глазных лекарственных формах".

Потеря в массе при высушивании. Не более 2,5%. Определение проводят в соответствии с ОФС "Определение потери в массе при высушивании".

Точность розлива. Не более 10%. Определение проводят весовым методом. 20 ампул без этикеток обрабатывают смесью спирта с эфиром и помещают в эксикатор на 3 ч. Затем верхнюю часть каждой ампулы надпиливают и удаляют. Вскрытые ампулы с веществом взвешивают на аналитических весах, после чего содержимое удаляют, ампулы промывают водой, ополаскивают водой очищенной. После этого ампулы выдерживают в сушильном шкафу при температуре 100-105°С до постоянной массы. По разности масс ампулы с содержимым и без него рассчитывают коэффициент вариации (V) в процентах по формуле:

, где

S - стандартное отклонение;

- среднее арифметическое значение массы вещества в ампуле;

X - масса вещества в каждой ампуле;

n - число ампул

Фосфор. Содержание фосфора в вакцине должно быть не менее 7,5%. Определение проводят в соответствии с ОФС "Спектрофотометрическое определение фосфора".

Молекулярные параметры. Не менее 65% полисахарида, элюируемого до достижения значения коэффициента распределения Кd, равного 0,50. Определение молекулярных параметров проводят методом эксклюзионной хроматографии в соответствии с методикой, изложенной в частной фармакопейной статье, где должны быть указаны: размеры хроматографической колонки, приведена характеристика носителя и его приготовление, методика приготовления элюирующего раствора, количество и способ введения испытуемого образца и стандартных растворов для калибрования колонки, скорость элюции подвижной фазы, условия калибрования колонки, объем элюируемых фракций, процедура сбора фракций.

Содержание полисахарида. Вакцина должна содержать не менее 70% и не более 130% содержания полисахарида, обозначенного в составе препарата. Определение проводят путем пересчета содержания фосфора или иммунохимическим методом, описанным в частной фармакопейной статье.

Стерильность. Вакцина должна быть стерильна. Определение проводят методом прямого посева по ОФС "Стерильность".

Аномальная токсичность. Вакцина должна быть нетоксичной. Определение проводят в соответствии с ОФС "Аномальная токсичность. Тест для вакцин и сывороток". Тест-доза для 5 белых мышей по 100 мкг полисахарида внутрибрюшинно, тест-доза для 2-х морских свинок по 500 мкг полисахарида внутрибрюшинно. Период наблюдения за животными составляет 7 суток.

Пирогенность. Вакцина должна быть апирогенной. Определение проводят в соответствии с ОФС "Пирогенность". Тест-доза 0,025 мкг/мл полисахарида в 1 мл 0,9% раствора натрия хлорида для инъекций на 1,0 кг массы животного.

Содержание лактозы. Содержание лактозы в вакцине должно быть в пределах
 мг в пересчете на ампулу. Определение проводят в соответствии с ОФС "Рефрактометрия". В 3 ампулы с вакциной добавляют по 1 мл воды очищенной. Содержимое ампул объединяют. На призму рефрактометра наносят 1 каплю раствора препарата и определяют показатель преломления. По калибровочному графику находят концентрацию лактозы. Содержание лактозы в 1 ампуле вычисляют как среднее арифметическое 3-х измерений.

Построение калибровочного графика. В 10 стеклянных пробирок вносят пипеткой по 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 и 1,0 мл основного раствора лактозы, доводят объем водой очищенной до 1 мл и перемешивают (содержание лактозы соответственно: 2,5; 5,0; 7,5; 10,0; 12,5; 15,0; 17,5; 20,0; 22,5 и 25,0 мг/мл). Измеряют показатель преломления каждого раствора и строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс количество лактозы в мг/мл, а по оси ординат - показатель преломления. Калибровочный график воспроизводят при каждом анализе.

Примечание. Основной раствор лактозы. 2,5 г лактозы моногидрата растворяют в воде очищенной в мерной колбе вместимостью 100 мл при нагревании на водяной бане при температуре не более 60°С. Объем раствора доводят до метки водой очищенной и перемешивают. Перед использованием охлаждают до комнатной температуры. Основной раствор используют свежеприготовленным.

Упаковка и маркировка. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные средства".

Хранение. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные средства".

Срок годности. В пределах срока годности, установленного частной фармакопейной статьей.