Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья ОФС "Определение однородности сывороточных препаратов методом электрофореза на плёнках из ацетата целлюлозы"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Общая фармакопейная статья ОФС
"Определение однородности сывороточных препаратов методом электрофореза на плёнках из ацетата целлюлозы"

Вводится взамен метода
изложенного в ФС 42-3874-99

Метод электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы предназначен для определения однородности (идентичности) сывороточных иммунобиологических лекарственных средств (иммуноглобулинов).

Метод основан на различной скорости перемещения белков в электрическом поле в зависимости от соотношения основных и кислотных групп белка, рН, ионной силы буферного раствора, величины заряда и молекулярной массы частиц. По скорости движения белков в электрическом поле они делятся на основные 5 фракций: альбумины, глобулины -1, глобулины -2, -глобулины и -глобулины.

Белки движутся в электрическом поле со скоростью пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд движутся к аноду (+), а положительно заряженные белки - к катоду (-). Наименьшей скоростью продвижения обладают gamma-глобулины, они практически остаются на линии старта их заряд близок к нейтральному (молекулярная масса 150 тыс. кДа). Альбумины обладают выраженным отрицательным зарядом и небольшой молекулярной массой (67-70 тыс. кДа), поэтому в электрическом поле они двигаются с наибольшей скоростью и дальше других фракций находятся от линии старта. С меньшей скоростью в электрическом поле движутся глобулины -1 , глобулины -2 и -глобулины.

Электрофорез на пленках из ацетата целлюлозы

На увлажнённую плёнку из ацетата целлюлозы размером 90х90 мм, заправленную в специальную рамку, наносят (2-4 мкл) исследуемых образцов лекарственного средства (5 образцов в 2-х параллельных определениях) и для идентификации контрольный образец - сыворотка для контроля качества электрофоретического разделения белковых фракций (определение проводят в 2-х параллельных определениях). Предварительно в электродные секции камеры (аппарат для электрофореза на плёнках из ацетата целлюлозы) наливают барбиталовый буферный раствор (рН 8,4) (вместо барбиталового буферного раствора можно использовать любой подходящий коммерческий буферный раствор, с указанным рН).

Рамку с пленкой из ацетата целлюлозы помещают в разделительную камеру, закрывают крышкой, включают источник питания (сила тока 8-10 мА, напряжение 100-129 В). Разделение проводят в течение 30-40 мин. После проведения электрофореза снимают крышку разделительной камеры, не допуская попадания конденсационной воды на пленку. Рамку с плёнкой извлекают из камеры, избегая контакта с участками, где происходил электрофорез испытуемых образцов. Пленку достают из рамки пинцетом и дают подсохнуть на воздухе. Затем плёнку обрезают с обоих концов (около 2,5 мм), помещают в кювету с 50 мл раствора красителя и выдерживают в течение не более 5 мин (т.к. выдерживание более 5 мин деформирует плёнку). Плёнку вынимают из кюветы и после стекания избыточной жидкости помещают на 5 мин поочерёдно в 3 кюветы, со 100 мл отмывочной жидкости (для ускорения процесса отмывки кювету покачивают). После отмывки фон плёнки должен приобрести бледно-голубое окрашивание или стать почти прозрачным. Далее плёнку тщательно промывают водой, помещают между листами фильтровальной бумаги и слегка промакают.

Идентификацию белковых фракций проводят путём сравнения электрофореграммы испытуемых образцов с электрофореграммой контрольной сыворотки для контроля качества электрофоретического разделения белковых фракций. Сыворотка должна разделиться не менее, чем на 5 фракций: альбумин, и - глобулины, -глобулин и -глобулин. После проведения электрофореза проводят количественное определение фракций иммуноглобулина путём извлечения краски из плёнки элюирующим раствором с последующим колориметрированием или путём денситометрии электрофореграмм.

Количественное определение фракций иммуноглобулина.

Колориметрическое определение.

Извлечение краски каждой фракции проводят в 3 мл элюирующего раствора с 2-х параллельных электрофореграмм. Элюцию проводят в течение 40 мин при многократном встряхивании. Оптическую плотность элюата измеряют на спектрофотометре при длине волны 620 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм по отношению к элюату неокрашенного участка электрофореграммы. Сумму оптических плотностей всех фракций принимают за 100% и рассчитывают процентное содержание каждой фракции иммуноглобулина.

Денситометрическое определение.

Электрофореграммы исследуемых образцов высушивают между листами фильтровальной бумаги в полиэтиленовом пакете (условия высушивания исключают деформацию плёнки). Высушенные плёнки просветляют вазелиновым маслом. Плёнки пропитывают вазелиновым маслом таким образом, чтобы в плёнке не остались пузырьки воздуха. Плёнку следует держать горизонтально и нижней поверхностью осторожно касаться масла. Избыток вазелинового масла удаляют, промокая плёнку между листами фильтровальной бумаги.

Фракции иммуноглобулина записанные денситометром представлены в виде пиков. Величина площади каждого пика, пропорциональна количеству краски, соединившейся с белком. Площадь каждого пика вычисляют по формуле площади прямоугольника (h x d, где h - максимальная высота пика, d - ширина пика). Сумму площадей всех пиков фракций иммуноглобулина принимают за 100% и вычисляют процентное содержание каждой фракции.

Примечания

Подготовка плёнки из ацетата целлюлозы. Плёнку смачивают в барбиталовом буферном растворе, гладкой стороной помещают в кювету на поверхность буферного раствора на 2 мин, а затем пинцетом погружают на дно кюветы и выдерживают 5 мин. Плёнку вынимают пинцетом, избыток влаги удаляют между листами фильтровальной бумаги и заправляют в рамку, избегая неравномерного натяжения и провисания.

Подготовка испытуемых образцов. Испытуемые образцы предварительно, обрабатывают 0,05% раствором красителя - бромфенолового синего, используемого для отслеживания продвижения и распределения фракций иммуноглобулина в процессе электрофореза. В пробирку типа Эппендорф помещают 100 мкл испытуемого образца и 10 мкл 0,05% раствора бромфенолового синего и перемешивают. Окрашенные испытуемые образцы в объеме 24 мкл помещают в каждую лунку лотка. Приготовление барбиталового буферного раствора (рН 8,4)*. 8,5 г барбитал-натрия помещают в мерную колбу вместимостью 1000 мл, растворяют в 600-700 мл воды, прибавляют 11 мл 1 М раствора хлористоводородной кислоты доводят объём раствора водой до метки и перемешивают.

Приготовление 1 М раствора хлористоводородной кислоты. 85 мл хлористоводородной кислоты концентрированной помещают в мерную колбу вместимостью 1000 мл, доводят объём раствора до метки и перемешивают.

Приготовление красителя. К 0,5 г амидочёрного 10 Б (импортный) прибавляют 10 мл ледяной уксусной кислоты, 3 г трихлоруксусной кислоты и 90 мл спирта и перемешивают. Для полного растворения краситель оставляют на 24 ч. Перед использованием раствор красителя перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр.

Приготовление раствора для отмывки электрофореграмм. 40 мл ледяной уксусной кислоты помещают в мерный цилиндр вместимостью 1 л, прибавляют 700 мл воды и перемешивают. Затем объём раствора доводят водой до метки и вновь перемешивают.

Приготовление элюирующего раствора. Смешивают 1 М раствор натрия гидроксида с 1 М раствором натрия эдетата в соотношении 10 мл 1 М раствора натрия гидроксида и 1 мл 1 М раствора натрия эдетата.

______________________________

* Вместо барбиталового буферного раствора можно использовать любой коммерческий буферный раствор.