Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья ОФС - 42 "Испытание вирусных вакцин на присутствие посторонних агентов"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Общая фармакопейная статья ОФС - 42
"Испытание вирусных вакцин на присутствие посторонних агентов"

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на методы обнаружения посторонних агентов в вирусных вакцинах.

Для производства вирусных вакцин допускается использовать только субстраты, одобренные национальными регулирующими органами. Если для приготовления иммунобиологических препаратов используются ткани животных или куриные (или других видов птиц) эмбрионы, а также приготовленные на их основе клеточные культуры, то животные и эмбрионы должны поступать из изолированных, постоянно контролируемых хозяйств, свободных от специфических патогенных агентов (SPF), если в НД нет других указаний.

На присутствие посторонних агентов должны быть испытаны:

- производственные клеточные культуры;

- объединенный вирусный сбор вакцинного и посевного вируса для живых и инактивированных вирусных вакцин;

- объединенный вирусный сбор (до добавления вспомогательных веществ) каждой серии живых вирусных вакцин.

В частных фармакопейных статьях на отдельные препараты, учитывая специфические особенности их производства, возможно введение дополнительных методов анализа.

1.Испытуемая контрольная клеточная культура

1.1.Исследование в клеточных культурах.

Испытанию подвергается не менее 500 мл клеточной суспензии в концентрации, используемой для посева клеточных культур-продуцентов вакцины.

Отобранную в качестве контрольной клеточную суспензию разливают во флаконы, клетки оставляют незараженными и инкубируют в тех же условиях, что и клетки, используемые для производства вакцины. За контрольной клеточной культурой наблюдают до последнего сбора вирусов с культур-продуцентов вакцины, но не менее 14 суток. В конце периода наблюдения контрольные клеточные культуры исследуют под световым микроскопом на наличие цитопатических изменений. Во время культивирования контрольных клеток не должно выявляться признаков дегенерации клеток.

По истечении срока наблюдения не менее 25% контрольных клеточных культур проверяют на наличие феномена гемадсорбции с 0,25% эритроцитами морской свинки, кур, человека I(0) группы при температуре от 2 до 8°С на 30 мин и последующей инкубации на 30 мин от 20 до 25°С. Взвесь эритроцитов сливают, клеточный монослой трижды отмывают раствором Хенкса или 0,9% раствором натрия хлорида и просматривают под микроскопом на наличие гемадсорбции.

Из оставшихся флаконов с контрольными культурами отбирают по 10 мл культуральной жидкости. Если на протяжении срока инкубации контрольных культур производят сливы вируссодержащей жидкости из производственных культур, то в те же сроки берут пробы культуральной жидкости из флаконов с контрольными культурами и сохраняют их при минус 20 °С. В конце наблюдения пробы культуральной жидкости с контрольных клеточных культур объединяют и вносят по 10 мл в 3 культуры клеток: гомологичную, приготовленную из другой партии производственного субстрата, культуру клеток человека и клеточную культуру, наиболее чувствительную для выявления вирусов - возможных контаминантов культуры-продуцента. От каждой клеточной культуры оставляют по одному контрольному флакону. Все культуры выдерживают при температуре °С в течение 14 суток. По окончании срока наблюдения все культуры проверяют на наличие цитопатических изменений и феномена гемадсорбции, какк указано выше.

Пробы считают прошедшими испытание, если в опытных и контрольных культурах, использованных для выявления посторонних агентов, отсутствуют цитопатические изменения и гемадсорбция.

Если при исследовании контрольных клеточных культур в одном из испытаний обнаружены цитопатические изменения или феномен гемадсорбции, то вирусный сбор, полученный в производственных культурах, не должен быть использован для приготовления вакцины.

1.2. Обнаружение группо-специфического (ГС) антигена вирусов лейкозно-саркоматозного комплекса птиц (Cofal-test).

Если для производства и контроля вакцин используются субстраты, приготовленные на основе эмбрионов кур или других птиц (например, перепелов), то для обнаружения группоспецифического антигена лейкозо-саркоматозного комплекса птиц (ГС-антиген) проводят реакцию связывания комплемента (РСК) (Cofal-test) по общепринятой методике.

Испытуемый антиген готовят из партии контрольных клеточных культур, используемых при производстве вирусных вакцин.

Клетки засевают в три флакона (по 150-160 тыс/кл на мл) и инкубируют при температуре °С в смеси равных объемов питательных сред Игла и 199 с добавлением 5% телячьей сыворотки. Через 5-7 суток после образования монослоя клетки субкультивируют не менее двух раз в течение 14 суток. По окончании инкубации культуральную жидкость из флаконов сливают, добавляют 4,0 мл 0,9% раствора натрия хлорида, затем клетки разрушают трехкратным замораживанием и оттаиванием и используют в РСК.

В качестве положительного антигена используют 10% суспензию опухоли вируса саркомы Рауса штамм Бриан или RSV(RAV-1) в 0,9% растворе натрия хлорида. При обнаружении в испытуемой культуре ГС-антигена вакцину бракуют.

2. Испытание вируссодержащего материала

Испытанию подлежит объединенный вирусный сбор, полученный в процессе приготовления вакцинного штамма, посевного вируса и полуфабриката вакцины до добавления вспомогательных веществ. Контроль проводят в клеточных культурах, на животных и куриных эмбрионах. Если образцы исследуют в течение первых 24 ч, то до проведения контроля их хранят при температуре от 2 до 8°С. При проведении контроля в более поздние сроки, образцы замораживают и хранят при температуре минус 20°С. Размораживание материала разрешается проводить не более одного раза.

2.1 Испытание в клеточных культурах

Испытуемый материал, (но не менее 50 мл вируссодержащей жидкости, если в частной фармакопейной статье нет других указаний) смешивают с иммунной сывороткой, взятой в количестве, достаточном для полной нейтрализации содержащегося в пробе вируса. Для получения иммунных сывороток используют животных, ткани которых не применяют при приготовлении клеточных культур-продуцентов вакцины. Антиген для иммунизации животных готовят в клеточных культурах, не используемых для проведения контроля.

Смесь инкубируют при заданной температуре в течение времени (1-2 ч), необходимого для нейтрализации вакцинного штамма вируса, затем вносят во флаконы с тремя указанными выше видами культур клеток. Для каждого вида культуры клеток оставляют один контрольный незараженный флакон.

Культуры выдерживают при температуре °С 14 суток со сменой среды (если это необходимо) на 4-6 суток. По истечении 14 суток опытные и контрольные клеточные культуры просматривают под микроскопом на наличие цитопатических изменений, трижды замораживают, оттаивают и производят пассаж на одноименной культуре, внося в нее не менее 25 мл неосветленной культуральной жидкости. Разведение вносимого материала поддерживающей средой не должно превышать четырехкратного. В случае, если для испытания используют перевиваемую клеточную линию, по истечении указанного срока инкубации возможно проведение субпассажа клеток.

После проведения пассажа опытные и контрольные культуры клеток инкубируют при температуре °С 14 суток со сменой среды на 4-6 суток, просматривая под микроскопом на наличие цитопатических изменений. По истечении срока наблюдения культуры проверяют в реакции гемадсорбции, как указано выше. Материал считают прошедшим контроль, если в опытных и контрольных культурах отсутствуют цитопатические изменения и гемадсорбция.

2.2. Испытание на животных

Используют здоровых животных, на которых ранее не проводили какие-либо испытания. В случае, если содержащийся в контролируемом материале вакцинный штамм вируса патогенен для животных, используемых для контроля, его предварительно нейтрализуют иммунной сывороткой, приготовленной как было указано выше.

2.2.1. Испытание на взрослых мышах

Используют от 10 до 20 мышей массой 15-20 г. Каждому животному вводят по 0,03 мл испытуемого материала интрацеребрально и по 0,5 мл интраперитонеально. За животными наблюдают от 21 до 28 суток. Все мыши, которые погибают позже 24 ч после введения материала, или с признаками заболевания, должны быть вскрыты и исследованы макроскопически. Если при макроскопическом исследовании не были выявлены признаки заболевания, из внутренних органов (печень, почки, селезенка, легкие, головной мозг) готовят 10% суспензии на 0,9% растворе хлорида натрия и вводят их интрацеребрально и интраперитонеально не менее чем 5 мышам, в дозах, указанных выше. За животными наблюдают 21 суток.

Материал считается прошедшим контроль, если на протяжении периода наблюдения остаются здоровыми не менее 80% инокулированных животных и ни у одного из них не выявляют признаки, указывающих на присутствие в вакцине посторонних агентов.

2.2.2. Испытание на новорожденных мышах

Используют не менее 20 новорожденных мышей не старше 24 ч (два-три помета). Каждому животному вводят по 0,01 мл испытуемого материала интрацеребрально и по 0,1 мл - интраперитонеально. За животными наблюдают 14 суток. Все мыши, которые погибают позже 24 ч, или у которых наблюдаются признаки заболевания, должны быть вскрыты и исследованы макроскопически на наличие спонтанной патологии, не связанной с введением препарата. При отсутствии патологии из внутренних органов (печень, почки, селезенка, легкие, головной мозг) этих мышей готовят 10% суспензии на 0,9% растворе натрия хлорида и вводят интрацеребрально и интраперитонеально не менее чем 5 новорожденным мышам в дозах, указанных выше. За животными наблюдают 14 суток. Материал считается прошедшим контроль, если на протяжении периода наблюдения остаются здоровыми не менее 80% инокулированных животных и ни у одного не выявляются признаки, указывающие на присутствие в вакцине каких-либо посторонних агентов.

2.2.3. Испытание на морских свинках

Используют не менее 5 морских свинок, массой 300-350 г. Каждому животному вводят по 0,1 мл испытуемого материала интрацеребрально и по 5,0 мл - интраперитонеально. За животными наблюдают 42 суток. Все животные, которые погибают позднее 24 ч после введения материала или с признаками заболевания, должны быть вскрыты и исследованы макроскопически, а внутренние органы (печень, селезенка, легкие, сердце, сальник) исследуются микроскопически. Материал считают прошедшим испытание, если не менее 80% инокулированных животных остаются здоровыми к концу периода наблюдения, и ни у одного из них не наблюдается признаков вирусной инфекции.

3. Испытание на куриных эмбрионах

Если содержащийся в контролируемом материале вакцинный штамм вируса патогенен для куриных эмбрионов, его необходимо предварительно нейтрализовать иммунной сывороткой, как было указано выше. Испытуемый материал вводят трем группам эмбрионов (по 10 штук).

Первой группе куриных эмбрионов 9-10 дневного возраста материал вводят по 0,2 мл в аллантоисную полость. Эмбрионы инкубируют при температуре °С 6-7 суток, аллантоисную жидкость исследуют в реакции гемагглютинации со смесью эритроцитов морской свинки, петуха и человека I (O) группы. С этой целью готовят 5-6 последовательных двукратных разведений аллантоисной жидкости от каждого инокулированного эмбриона, добавляют равные объемы 0,5% суспензии (на 0,9% растворе натрия хлорида) соответствующих эритроцитов, инкубируют 30-40 мин при температуре от 20 до 25°С и учитывают результаты. Материал считают прошедшим испытание, если в течение срока наблюдения не менее 80% инокулированных эмбрионов остаются живыми и ни в одной пробе аллантоисной жидкости не выявлено гемагглютинирующих агентов.

Второй группе куриных эмбрионов 5-6 дневного возраста материал вводят по 0,2 мл в желточный мешок. Эмбрионы инкубируют при температуре °С 10-12 сут.

Материал считается прошедшим испытание, если к концу указанного срока инкубации остаются живыми не менее 80% инокулированных эмбрионов, а в мазках ткани желточных мешков, окрашенных гематоксилин-эозином по Романовскому-Гимза не выявляется элементарных телец.

Третьей группе куриных эмбрионов 10-11 дневного возраста материал вводят по 0,2 мл на хорионаллантоисную оболочку и инкубируют при (°С в течение 6-7 суток. По истечении указанного срока оболочки извлекают и просматривают в проходящем свете на черном фоне на наличие патологических изменений.

Материал считается прошедшим испытание, если к концу указанного срока инкубации остаются живыми не менее 80% инокулированных эмбрионов и на хорионаллантоисных оболочках всех эмбрионов отсутствуют изменения, видимые невооруженным взглядом.

4. Испытание на присутствие микоплазм

Контролю подлежат: культуральная жидкость контрольных клеточных культур, объединенный вирусный сбор, полученный в процессе приготовления вакцинного штамма, посевного вируса и полуфабриката вакцины до добавления вспомогательных веществ живых и инактивированных вирусных вакцин. Применяют питательную среду на основе гидролизата бычьего сердца.

При наличии роста микоплазм хотя бы в одной пробирке материал бракуют.

5. Испытание на присутствие микобактерий туберкулеза

Испытание на присутствие микобактерий туберкулеза проводят высевом на питательные среды или методом ПЦР в соответствии с инструкцией по применению.

Если субстратом производства вакцины является культура птичьего происхождения, испытание на отсутствие микобактерий должно проводиться на питательной среде.

Испытанию подлежат сливы с контрольных (не зараженных вирусом) флаконов с культурой клеток. Исследование проводят путем высева культуральной жидкости на среду Левенштейна-Йенсена. Перед посевом 20 мл исследуемого материала центрифугируют в течение 15 мин при 4000 об/мин, надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в 1 мл 0,9% раствора натрия хлорида и высевают по 0,2 мл на 5 пробирок со средой. Учёт производят через 45 суток инкубации при температуре °С. Колонии микобактерий должны отсутствовать.

Методы выявления контаминирующих агентов в ИЛП должны быть наиболее современными и информативными и применяться с учетом сложности технологического процесса приготовления препаратов и в соответствии с требованиями, изложенными в частных НД. Методы, изложенные в настоящей ОФС, соответствуют международным рекомендациям.