Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья ОФС 42- "Иммуногенность адсорбированного столбнячного анатоксина"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Общая фармакопейная статья ОФС 42-
"Иммуногенность адсорбированного столбнячного анатоксина"

Вводится впервые

Специфическую (иммуногенную) активность адсорбированного столбнячного анатоксина, входящего в состав моно- и комбинированных и вакцин, определяют по его способности защищать иммунизированных животных от заражения столбнячным токсином и выражают в количестве Международных единиц (МЕ) активности, содержащихся в 1 мл или 1 прививочной дозе (0,5 мл). Активность столбнячного анатоксина в МЕ/мл рассчитывают путем сопоставления его количества и количества соответствующего референс-препарата, калиброванного в МЕ, необходимых для защиты 50% животных от летального заражения столбнячным токсином. Для определения специфической активности используют метод множественных разведений. При стабильно воспроизводимых показателях активности адсорбированного столбнячного анатоксина и стандартной технологии производства возможно использование метода с одним разведением.

Метод множественных разведений

Разными дозами испытуемого препарата иммунизируют не менее 3 групп мышей массой  г, по 16-20 животных в группе. Не менее 3 аналогичных групп животных иммунизируют разными дозами референс-препарата, калиброванного в МЕ. Разведения вакцины и референс-препаратов выбирают таким образом, чтобы наименьшая доза защищала от заражения не более 20%, а наибольшая доза - не менее 80% иммунизированных животных.

Через 28 сут животным вводят по 50 столбнячного токсина. Наблюдение проводят в течение 4 сут, регистрируя число выживших животных, и рассчитывают величины для вакцины (в мл) и референс-препарата (в МЕ). На основании полученных результатов определяют количество МЕ в 1 мл вакцины.

Материалы и животные:

- референс-препарат (стандартный образец активности адсорбированного столбнячного анатоксина, калиброванный в МЕ по соответствующему Международному стандартному образцу)

- испытуемый препарат,

- столбнячный токсин с предварительно установленной дозой (доза токсина, вызывающая гибель 50% животных в течение 4 сут),

- мыши массой тела 14-16 г

Приготовление разведений референс-препарата

Референс - препарат разводят стерильным 0,9% раствором натрия хлорида (рН и готовят не менее трех последовательных разведений с двойным шагом (например: 0,5, 1.0 и 2 МЕ/0,5 мл).

Приготовление разведений испытуемого препарата

Разведения испытуемого препарата готовят, соблюдая те же условия, что и при приготовлении разведений референс-препарата.

Иммунизация животных

Разведения референс-препарата и испытуемого препарата, вводят по 0,5 мл группам

белых мышей однократно под кожу внутренней поверхности верхней трети бедра.

Введение столбнячного токсина

По истечении 28 сут всем иммунизированным животным вводят под кожу внутренней поверхности верхней трети бедра по столбнячного токсина в объеме 0,5 мл. Опыт сопровождают контролем величины столбнячного токсина. Для этого неиммунизированным мышам из той же партии, распределенным в 3 группы (не менее 4 мышей в каждой группе), вводят столбнячный токсин в дозах 0,5, 1 и 2 . За иммунизированными животными и животными контрольной группы наблюдают 4 сут, регистрируя число выживших без явлений столбняка.

На основании полученных результатов проводят расчет иммуногенной активности столбнячного анатоксина с помощью программы "Probit" или по формуле Кербера, определяя величины для референс-препарата и испытуемой вакцины. Рассчитывают количество токсина, введенного иммунизированным животным.

Примечание: для расчета результатов испытаний с помощью программы "Probit" следует использовать не менее 3 разведений испытуемых образцов, при которых значения Li отличны от 0 и 1.

Формула Кербера:

- для испытуемого прерпарата и референс-препарата:

,

- для токсина:

,

где:

- величина максимальной из испытуемых доз;

- логарифм кратности разведения (отношение большей дозы к следующей за ней меньшей дозе);

Li - отношение количества выживших без явлений столбняка (для - павших) животных к общему числу животных, получивших данную дозу;

- сумма значений Li, найденных для всех испытуемых доз.

Испытание считается проведенным правильно, если:

- вычисленное значение лежит между наибольшей и наименьшей дозами препаратов, введенными мышам;

- пределы доверительного интервала (Р=0,95) не меньше чем 50% и не больше чем 200% от величины вычисленной активности;

- разрешающая доза столбнячного токсина приблизительно равно 50 .

Метод с одним разведением

Принцип метода заключается в сравнении активности единичных разведений вакцины и референс-препарата, калиброванного в МЕ.

По данным тестов с тремя разведениями выбирают дозу референс - препарата, обеспечивающую выживаемость 10-20% иммунизированных животных при заражении разрешающей дозой токсина. Разведение вакцины готовят с таким расчетом, чтобы получить подтверждение того, что ее активность значительно выше минимально требуемой.

Животных делят на две группы (не менее 12 животных в каждой), одну из которых иммунизируют испытуемого препарата, а другую референс - препаратом. Препараты вводят подкожно в объеме 0,5 мл. Через 28 сут всем иммунизированным животным вводят разрешающую дозу столбнячного токсина в объеме 0,5 мл. Опыт сопровождают контролем величины столбнячного токсина. За животными наблюдают 4 сут, регистрируя число выживших без явлений столбняка в каждой группе. Результаты выражают как отношение числа выживших без явлений столбняка мышей в каждой группе к общему числу животных, получивших данную дозу вакцины или референс-препарата. В опытной группе количество выживших животных должно достоверно быть выше, чем в контроле. Достоверность различия определяют с помощью точного критерия Фишера (одностороннего, Р<0,05). При значении различия считаются недостоверными.

Таблица 1 - расчета значения доверительного интервала (Р)

Количество испытуемых животных	Выжило	Пало	Всего
Опыт	a	b	T
Контроль	c	d	R
Всего	n+	n-	N

Вычисление Р проводят по формуле:

где "!" - знак факториала (означает произведение всех натуральных чисел от 1 до числа, стоящего перед знаком "!" включительно).