Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья ОФС 42 "Определение молекулярных параметров иммуноглобулинов методом ВЭЖХ"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Общая фармакопейная статья ОФС 42
"Определение молекулярных параметров иммуноглобулинов методом ВЭЖХ"

Вводится взамен метода,
изложенного в ФС 42-3874

Метод предназначен для определения молекулярных параметров иммуноглобулинов методом эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Механизм процесса эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии заключается в хроматографическом распределении молекул иммуноглобулинов в соответствии с их размером и молекулярными массами. Основные положения эксклюзионной ВЭЖХ описаны в ОФС "Высокоэффективная жидкостная хроматография".

Метод эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии вводится впервые взамен метода гель-фильтрации.

Метод эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии

Процесс эксклюзионной ВЭЖХ происходит в водной среде и называется гель-фильтрационным, в результате чего происходит распределение молекул иммуноглобулинов по их размеру в широком диапазоне молекулярных масс от 10000 до 600000 дальтон. Отличительной способностью ВЭЖХ является использование высокого давления (до 400 бар) и мелкозернистых сорбентов (3-5 мкм). Это позволяет разделять сложные смеси веществ быстро и полно.

Принципиальные основы метода заключаются в объеме эксклюзионной колонки, который можно выразить суммой трех слагаемых: Vc = Vo + Vi + Vd, где Vo - свободный объем подвижной фазы; Vi - объем пор, заполненный подвижной фазой (объем неподвижной фазы); Vd - объем матрицы сорбента без учета пор. Полный объем подвижной фазы колонки

(Vt) представляет собой сумму объемов подвижной и неподвижной фаз: Vt = Vo + Vi. Удерживание молекул в эксклюзионной колонке определяется вероятностью их диффузии в поры и зависит в основном от соотношения размеров молекул и пор. Коэффициент распределения Кd представляет собой отношение концентраций вещества в неподвижной и подвижной фазах (Со): . Время удерживания молекул иммуноглобулинов зависит от силы взаимодействия вещества с подвижной и неподвижной фазами.

Анализ иммуноглобулинов проводят в соответствии с методиками, изложенными в частных фармакопейных статьях с описанием: пробоподготовки исследуемого образца; приготовления стандартных образцов; приготовления подвижной фазы; хроматографических условий: приводится характеристика хроматографической колонки, (марка (тип), размеры, диапазон разделения молекулярных масс; указывается состав и название подвижной фазы; наименование носителя (сорбента); детектор, длина волны; объем вводимой пробы; температура колонки; скорость потока подвижной фазы; последовательность (порядок) ввода проб; время хроматографирования.

В процессе разделения фракций иммуноглобулинов на хроматографической колонке белковые молекулы иммуноглобулина с молекулярной массой более 400000 дальтон свободно проходят между гранулами носителя (сорбента) не попадая и не задерживаясь в пористых гранулах, более мелкие молекулы частично попадают и задерживаются в гранулах и медленнее вымываются из гранул подвижной фазой, мелкие молекулы с молекулярной массой менее 50000 дальтон попадают в гранулы носителя и медленно вымываются подвижной фазой. Распределение по времени удерживания (выхода) компонентов (фракций) иммуноглобулинов указывается в частной фармакопейной статье и происходит в порядке уменьшения их молекулярных масс: полимеры (агрегаты), димеры, мономеры Ig G - основная фракция иммуноглобулинов и фрагменты.

Количественный анализ иммуноглобулинов состоит из следующих стадий: 1) хроматографическое разделение; 2) измерение площадей пиков или высоты пиков; 3) расчет количественного состава фракций иммуноглобулинов на основании хроматографических данных; 4) интерпретация полученных результатов, т.е. статистическая обработка.

Содержание компонентов (фракций) иммуноглобулинов вычисляется по площадям пиков в процентах автоматически с помощью программного обеспечения счетно-аналитического прибора. Процентное содержание определяемых компонентов иммуноглобулинов должно соответствовать требованиям, указанным в частной фармакопейной статье.

По стандартным образцам оценивается пригодность хроматографической системы.

Хроматографическая система считается пригодной, если выполняются условия, описанные в частной фармакопейной статье: фактор разрешения (R) между пиками, эффективность хроматографической колонки, рассчитанная по пикус указанием числа теоретических тарелок, относительное стандартное отклонение площадей пиков.

Примечания

Испытуемый раствор. Образцы иммуноглобулина перед анализом разводят, как указано в частной фармакопейной статье.

Подвижная фаза. Подвижную фазу готовят в соответствии с методикой, изложенной в частной фармакопейной статье.

Стандартные образцы:

- раствор для проверки пригодности хроматографической системы

- маркеры для эксклюзионной ВЭЖХ с молекулярной массой в диапазоне от 10000 до 600000 дальтон. Приготовление маркеров проводят в соответствии с инструкцией по применению или в соответствии с методикой, изложенной в частной фармакопейной статье.

- стандартный образец (СО) "Иммуноглобулин человека нормальный для калибрования хроматографической колонки" соответствующего года выпуска. Приготовление СО описывается в инструкции по применению.