Государственный стандарт качества лекарственного средства. Общая фармакопейная статья "Оценка подлинности аллергенов методом иммуноферментного анализа (ИФА)"

Государственный стандарт качества лекарственного средства
Общая фармакопейная статья
"Оценка подлинности аллергенов методом иммуноферментного анализа (ИФА)"

Вводится впервые

Метод оценки подлинности аллергенов основан на твердофазном ИФА, с использованием аллергенспецифических сывороток, для определения аллергенспецифических IgE антител.

Метод оценки подлинности распространяется на бытовые, пыльцевые, эпидермальные и пищевые аллергены, на бытовые и пыльцевые аллергоиды.

Принцип метода

Исследуемый аллерген сорбируют в лунках полистеролового планшета. На аллергосорбент наносят образцы специфических сывороток крови, содержащие специфические IgE антитела к этому аллергену, в результате чего образуется комплекс антиген-антитело.

К образовавшемуся в лунке планшета комплексу добавляют конъюгант - моноклональные анти-IgE антитела, меченные пероксидазой, который присоединяется к образовавшемуся комплексу, и индикатор - тетраметилбензидин (ТМБ) в субстратном буфере. В лунках планшета с положительной реакцией проявляется цветное окрашивание.

Оптическую плотность цветного окрашивания оценивают спектрофотометрически.

Учет реакции проводят с помощью референс-системы (1), состоящей из референс-аллергена (аллерген из пыльцы амброзии) и референс-сыворотки (сыворотка крови больных с содержанием IgE антител к аллергену из пыльцы амброзии на уровне не менее 4 класса или 17,6-50 МЕ\мл).

Оценку уровня реакции осуществляют по показателям оптической плотности (ОП) четырех разведений референс-сыворотки (1:1; 1:5; 1:25; 1650, которые соответствуют 4, 3, 2 и 1 классу уровня концентрации аллергенспецифических IgE антител.

В таблице 1 представлена взаимосвязь между уровнем аллергенспецифических IgE антител в классах и их соответствующих концентраций.

Таблица 1. Распределение уровней аллергенспецифических IgE антител в классах при соответствующих концентрациях

Класс	Концентрация (кЕ/л)	Комментарии
0	< 0,35	Отрицательная реакция
1	0,35-0,70	Очень слабая реакция
2	0,71-3,5	Слабо положительная реакция, клинические проявления редко присутствуют
3	3,6-17,5	Положительная реакция, клинические проявления часто присутствуют
4	17,6-50,0	Резко положительная реакция, клинические проявления всегда присутствуют

Аллергенспецифические сыворотки (характеристика и получение)

Венозную кровь для получения аллергенспецифических сывороток получают от больных, страдающих аллергическими заболеваниями, с положительными кожными пробами, специфичность которых подтверждена , в количестве 10-15 мл (от каждого больного) в стерильные химические пробирки и помещают на 1 ч в термостат °С, а затем на 16-18 ч в холодильник °С.

Образовавшийся в результате этого сгусток крови отделяют от стенок пробирок стеклянной палочкой. Сыворотку осторожно сливают со сгустка. Если в сыворотке имеются примеси форменных элементов крови, их удаляют центрифугированием. Полученную сыворотку хранят при °С в течение 5 дней или при минус 40°С (до 1 года).

Для оценки подлинности препаратов применяют только сыворотки крови, содержащие аллергенспецифические антитела к исследуемым аллергенам на уровне 3-4 класса (таблица 1), которые далее используются в качестве положительного контроля.

Уровень специфических IgE-антител, выраженный в классах, оценивают с помощью тест-системы для определения аллергенспецифических IgE-антител "IgE-АТ-ИФТС" согласно Инструкции по применению этого набора.

Материалы и реагенты

1. Испытуемый препарат - готовая лекарственная форма аллергена или аллергоида.

2. Референс-аллерген из пыльцы амброзии PNU/мл.

3. Референс-сыворотка - сыворотка крови больных амброзийным поллинозом, имеющая уровень специфических IgE антител, соответствующий 4 классу.

4. Положительный контроль - аллергенспецифические сыворотки от больных аллергическими заболеваниями, имеющие уровень специфических IgE антител к исследуемому аллергену, соответствующий 3-4 классам.

5. Отрицательный контроль - сыворотка крови, не содержащая аллергенспецифических IgE антител также используется для разведения референс-сыворотки.

6. 0,05 М буфер натрия карбоната ("Fixanal", кат N 38170, Германия).

7. Система тетраметилбензидин (ТМБ) пероксидазы субстрат ("KPL", кат. N 50-76-02, США), включающая в себя раствор ТМБ и субстратный буфер (раствор В).

8. Конъюгат - мышиные моноклональные антитела к иммуноглобулину Е человека с пероксидазой хрена, рабочий титр 1:100 (реагент тест-системы "IgE-АТ-ИФТС").

9. Разводящий и промывающий раствор (10 х концентрат) - фосфатно-солевой буферный раствор с твином с рН 7.1 - 7.3 (реагент тест-системы "IgE-AT-ИФТС").

10. Стоп-реагент - 10% раствор серной кислоты.

11. Вода очищенная.

Оборудование

1. Многоканальный фотометр вертикального сканирования для 96-луночных планшетов типа "Мультискан".

2. Дозаторы пипеточные со сменными наконечниками: одноканальные, позволяющие отбирать объемы жидкости от 10 до 1000 мкл; многоканальные, позволяющие отбирать объемы жидкости от 50 до 300 мкл.

Приготовление растворов

Для проведения метода оценки подлинности препаратов аллергенов необходимо приготовления ряда растворов - буферного, раствора ТМБ, разводящего и промывающего растворов, конъюгата, референс-сыворотки.

1) Буферный раствор для сорбции препаратов - 0,01 М буферный раствор натрия карбоната, рН 9,5:

- 2 мл 0,05 М раствора натрия карбоната смешивают с 8 мл очищенной воды (на один планшет для ИФА).

2) Раствор ТМБ:

- 2,5 мл ТМБ пероксидазы субстрата смешивают с 2,5 мл раствора В пероксидазы субстрата (на один планшет для ИФА). Готовят за 10 мин. до внесения в планшет.

3) Приготовление рабочих растворов реагентов "IGE-АТ-ИФТС" (разводящий и промывающий растворы, референс-сыворотка, конъюгант) приведены в таблице 2.

Таблица 2. Приготовление рабочих растворов реагентов "IGE-АТ-ИФТС"

Рабочие растворы	Приготовление (на 1 планшет)	Хранение
Разводящий и промывающий раствор (N 1)	50 мл довести до 500 мл очищенной водой рН (7,2-7,4)	В течение суток
Раствор конъюгата (N 2)	0,1 мл довести до 10 мл рабочий раствор N 1	Готовить непосредственно перед употреблением
Растворы референс-сыворотки
Раствор А (без разведения)	Референс-реагент	Хранить при °С в течение 1 суток
Раствор В (1:5)	К 0,1 мл раствора А добавляют 0,4 мл отрицательной сыворотки	-"-
Раствор С (1:25)	К 0,05 мл раствора А добавляют 0,95 мл отрицательной сыворотки	-"-
Раствор D (1:50)	К 0,05 мл раствора В добавляют 0,450 мл отрицательной сыворотки	-"-

Методика оценки подлинности аллергенных препаратов

Подготовка аллергенов к сорбции.

Испытуемый препарат и референс-аллерген амброзии с помощью буфера для сорбции доводят до концентрации белкового азота, равной PNU/мл.

Сорбция препаратов.

Референс-аллерген в объеме 100 мкл вносят в первые два вертикальных ряда планшета. В лунки вертикальных рядов (стрипов) с 3 по 12 в объеме 100 мкл вносят растворы тестируемых аллергенов (по 1 стрипу на одну тестируемую серию препарата).

Планшет закрывают крышкой и инкубируют 16-18 ч при температуре °С.

После инкубации содержимое планшета сливают и промывают 3 раза промывающим и разводящим растворами (по 200 мкл\лунку).

Формирование планшета:

Собирают планшет - 1-й и 2-й вертикальные ряды (стрипы) с референс-аллергеном, начиная с ряда 3 - стрипы с испытуемым препаратом.

Примечание

Аллергоид тестируется параллельно на одном планшете с одноименным аллергеном. Количество стрипов с аллергеном и аллергоидом должно быть одинаковым.

Микст-аллерген/аллергоид тестируется параллельно с не менее, чем с 3-мя аллергенами, входящими в его состав.

1. Во все лунки 1 ряда вносят по 100 мкл раствора N 1 (контроль конъюгата), в оставшиеся лунки остальных рядов - по 50 мкл этого же раствора.

2. Во 2 ряд вносят по 50 мкл растворов референс-сыворотки: в лунки А, В - раствор А; в лунки С, D - раствор В; в лунки E,F - раствор С; в лунки G,H - раствор D.

3. В оставшиеся ряды вносят по 50 мкл положительного и отрицательного контролей: в лунки А- F - одноимённые положительные сыворотки к тестируемому препарату, в лунки G,H - аффинноочищенную сыворотку.

4. Планшет закрывают крышкой и помещают в термостат с температурой °С на 1 ч.

5. После инкубации жидкость из лунок удаляют и в каждую лунку вносят по 200 мкл раствора N 1 на 2-3 мин, после чего жидкость вновь удаляют. Процедуру отмывки повторяют не менее 2-х раз.

6. В каждую лунку планшета вносят по 100 мкл рабочего раствора N 2 (конъюгат) и проводят инкубацию (п. 4).

7. Отмывку планшета проводят согласно п. 5, повторив процедуру не менее 5-ти раз.

8. Во все лунки планшета вносят по 50 мкл раствора ТМБ. Планшет помещают в тёмное место и выдерживают в течение 15-20 мин при температуре от 18 до 25°С.

9. Реакцию останавливают добавлением по 25 мкл во все лунки стоп-реагента и проводят учет результатов. Время между остановкой реакции и учётом результатов не должно превышать 10 мин.

10. В лунках, где прошла реакция, появится синее окрашивание разной степени интенсивности. Лунки первого ряда (контроль конъюгата) должны оставаться неокрашенными.

Учет результатов

Учёт результатов проводят фотометрически при длине волны равной 450 нм. Предварительно устанавливают "ноль" прибора без контроля реагентов.

Вычисляют средние арифметические показателей оптической плотности (ОП) одноимённых лунок.

Анализ считается положительным, если

- среднее значение показателей ОП лунок контроля конъюгата (КК) не превышает 0,10 (визуально окрашивания лунок не видно)

- среднее значение показателей ОП лунок референс-сыворотки без разведения (А) больше 1,0, но меньше 2,5

- соотношение средних показателей ОП с разведениями референс-сыворотки (растворы А, B, C, D) следующие: ОП раствора А > ОП раствора В > ОП раствора С > ОП раствора D

- среднее значение показателей ОП раствора D в 1,5-2,0 больше среднего значения показателей ОП отрицательной сыворотки.

Рассчитывают уровень специфических IgE антител в аллергенспецифических сыворотках (положительный контроль), используя таблицу 3.

Таблица 3. Расчет уровня специфических IgE антител в аллергенспецифических сыворотках (положительный контроль)

Уровень IgE (классы)	Интервалы ОП растворов референс-сыворотки
4	От ОП лунок А и выше
3	От ОП лунок В до А
2	От ОП лунок С до В
1	От ОП лунок D до С
0	Меньше ОП лунок D

Интерпретация результатов

Препарат является подлинным, если в результате теста уровень IgE антител в аллергенспецифической сыворотке (положительный контроль) будет равен исходному значению или же отличаться от него на 1 класс для аллергена и на 2 класса для аллергоида.

Пример: оценка подлинности аллергена из пыльцы полыни горькой и аллергоида пыльцевого полыни горькой.

Тестируемые препараты:

- аллерген из пыльцы полыни горькой (10000 PNU/мл)

- аллергоид пыльцевой полыни горькой (10000 PNU/мл)

Проведение анализа

1. Приготовление рабочих растворов и их обозначения (см. п. "Приготовление растворов")

2. Аллерген из пыльцы полыни, аллергоид пыльцевой полыни и референс-аллерген амброзии с помощью буфера для сорбции разводят до концентрации белкового азота, равной PNU/мл.

3. Референс-аллерген в объеме 100 мкл вносят в первые два вертикальных ряда планшета. В лунки вертикального ряда 3 вносят раствор аллергена из пыльцы полыни в объеме 100 мкл, ряда 4 вносят раствор аллергоида пыльцевого полыни в объеме 100 мкл (см. схему заполнения планшета).

Планшет закрывают крышкой и инкубируют 16-18 ч при °С в холодильнике.

4. Во все лунки 1 ряда вносят по 100 мкл раствора N 1 (контроль конъюгата), в оставшиеся лунки остальных рядов - по 50 мкл этого же раствора.

Во 2 ряд вносят по 50 мкл растворов референс-сыворотки: в лунки А, В - раствор А; в лунки С, D - раствор В; в лунки E,F - раствор С; в лунки G,H - раствор D.

В ряды 3 и 4 вносят по 50 мкл положительного и отрицательного контроля: в лунки А- F - аллергенспецифическая сыворотка (АС), содержащая 3 класс IgE антител к аллергену полыни, в лунки G,H - не содержащую IgE антител сыворотку.

5. Планшет закрывают крышкой и помещают в термостат с температурой °С на 1 час.

Схема заполнения планшета

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

КК

А

АС

АС

B

КК

А

АС

АС

C

КК

В

АС

АС

D

КК

В

АС

АС

E

КК

C

АС

АС

F

КК

C

АС

АС

G

КК

D

ОС

ОС

H

КК

D

ОС

ОС

Референс-аллерген

Референс-аллерген

Аллерген полыни

Аллергоид полыни

Примечание:

КК - контроль конъюгата

А, В, C, D - растворы референс-сыворотки

АС - аллергенспецифическая сыворотка ОС - отрицательная сыворотка

6. По истечении времени инкубации жидкость из лунок удаляют в емкость с дезинфицирующим раствором. В каждую лунку вносят по 200 мкл раствора N 1 на 2-3 мин, после чего жидкость вновь удаляют. Процедуру отмывки повторяют не менее 2-х раз.

7. В каждую лунку планшета вносят по 100 мкл рабочего раствора N 2 (конъюгат) и проводят инкубацию (п. 8.5).

8. Отмывку планшета проводят согласно п. 5, повторив процедуру не менее 5-ти раз.

9. Во все лунки планшета вносят по 50 мкл раствора ТМБ. Планшет помещают в тёмное место и выдерживают в течение 15-20 мин при температуре от 18 до 25 °С.

Реакцию останавливают добавлением по 25 мкл во все лунки стоп-реагента и проводят учет результатов. Время между остановкой реакции и учётом результатов не должно превышать 10 мин.

В лунках, в которых прошла реакция, должно появиться синее окрашивание разной степени интенсивности. Лунки первого ряда (контроль конъюгата) должны оставаться неокрашенными.

Таблица 4 . Результаты анализа

	Показатели ОП	Классы уровня IgE
Растворы референс-сыворотки:
А		4
В		3
C		2
D		1
ОС		0
АС (аллерген)		3
АС (аллергоид)		3

ГАРАНТ:

Здесь и далее по тексту нумерация разделов и пунктов приводится в соответствии с источником

8.11. Учёт результатов.

Учёт результатов проводят фотометрически при длине волны равной 450 нм. Предварительно устанавливают "ноль" прибора без контроля реагентов.

Вычисляют средние арифметические показателей оптической плотности (ОП) одноимённых лунок и заполняют таблицу.

Вывод: полученные результаты свидетельствуют о подлинности исследуемых препаратов (аллергена из пыльцы полыни горькой, аллергоида пыльцевого полыни горькой), поскольку выявлено соответствие зарегистрированного уровня IgE антител в аллергенспецифической сыворотке уровню исходного значения IgE (3 класс) этой же сыворотки.