Методические указания МУК 4.1.1734-03 "Измерение массовых концентраций 3-[(4-амино-2-метил-5-пиридил)метил]-4-метил-5-(4,5,6-тригидрокси-3,5-дио кса-4,6-дифосфагекс-1-ил) тиазолия хлорида Р,Р-диоксида (кокарбоксилазы) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 29 июня 2003 г.)

Методические указания МУК 4.1.1734-03
"Измерение массовых концентраций 3-[(4-амино-2-метил-5-пиридил)метил]-4-метил-5-(4,5,6-тригидрокси-3,5-диокса-4,6-дифосфагекс-1-ил) тиазолия хлорида Р,Р-диоксида (кокарбоксилазы) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 29 июня 2003 г.)

Дата введения: с момента утверждения

1. Область применения

Настоящие методические указания устанавливают количественный хроматографический анализ воздуха рабочей зоны на содержание кокарбоксилазы в диапазоне массовых концентраций от 0,15 до 3,00 .

2. Характеристика вещества

2.1. Структурная формула

2.2. Эмпирическая формула .

2.3. Молекулярная масса 460,8.

2.4. Регистрационный номер CAS 154-87-0.

2.5. Физико-химические свойства.

Кокарбоксилаза - кристаллический порошок белого цвета, температура плавления 230-240°С (с разложением). Растворима в воде и этиловом спирте, малорастворима в эфире и других органических растворителях, растворима в смеси ацетонитрила и воды.

Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль.

2.6. Токсикологическая характеристика.

Кокарбоксилаза обладает общетоксическим действием. Влияет на нервную систему и клеточный состав крови.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 0,3 . Класс опасности - второй.

3. Погрешность измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений массовых концентраций кокарбоксилазы с погрешностью не более % в диапазоне 0,15-1,00 и 17% в диапазоне 1-3 при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Измерения массовых концентраций кокарбоксилазы основаны на использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением спектрофотометрического детектора при длине волны 250 нм.

Отбор проб проводится с концентрированием на фильтр.

Нижний предел измерения содержания кокарбоксилазы в хроматографируемом объеме раствора 0,020 мкг.

Нижний предел измерения концентрации кокарбоксилазы в воздухе 0,15 (при отборе 400 воздуха).

Метод специфичен в условиях производства готовой лекарственной формы кокарбоксилазы. Определению не мешают сопутствующие вещества - этиловый спирт, фосфаты, крахмал, целлюлоза микрокристаллическая, титана оксид, поливинилпирролидон низкомолекулярный.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Хроматограф жидкостный микроколоночный типа "Милихром" со спектрофотометрическим детектором
Хроматографическая колонка стальная КАХ-44-3, 50х2 мм, заполненная сорбентом
Сепарон С18, фракция 5 мкм
Пробоотборное устройство ПУ-2Э	ГОСТ Р 51945-02
Фильтродержатель	ТУ 95.72.05-77
Весы аналитические ВЛА-200	ГОСТ 24104-88Е
Пинцет медицинский	ГОСТ 21241-89
Набор для фильтрации растворов на 0,25 , производство НПФ "Биохром"
Колбы мерные, вместимостью 25, 50 и 500	ГОСТ 1770-74Е
Пипетки, вместимостью 0,2, 1, 2, 5 и 10	ГОСТ 29227-91
Цилиндр мерный, вместимостью 500	ГОСТ 1770-74Е
Пробирки с пришлифованными пробками, вместимостью 10	ГОСТ 25336-82Е
Бюксы 50/30	ГОСТ 25336-82Е
Фильтра АФА-ВП-10	ТУ 95-743-80

5.2. Реактивы

Кокарбоксилаза, содержание основного вещества не менее 97,0%	ФС 42-1437-89
Ацетонитрил "для жидкостной хроматографии"	ТУ-6-09-14-2167-84
Калий дигидрофосфат, хч	ГОСТ 4198-75
Кислота ортофосфорная, хч	ГОСТ 5.2552-58
Вода дистиллированная	ГОСТ 6709-72

Допускается применение иных средств измерения, вспомогательных устройств, реактивов и материалов, обеспечивающих показатели точности, установленные для данных методических указаний.

6. Требования безопасности

6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают меры противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-76.

6.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

7. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений и обработке результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, имеющие навыки работы на жидкостном хроматографе.

8. Условия измерений

8.1. Приготовление растворов и подготовку проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха ()°С, атмосферном давлении 84-106 кПа и относительной влажности воздуха не более 80%.

8.2. Измерения на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9. Подготовка к выполнению измерения

9.1. Приготовление растворов

9.1.1. Стандартный раствор кокарбоксилазы концентрацией 1 готовится растворением 50 мг вещества в элюенте в мерной колбе вместимостью 50 . Раствор устойчив в течение недели при хранении в холодильнике.

9.1.2. Раствор дигидрофосфата калия концентрацией 0,02 М готовят растворением 1,36 г указанной соли в 500 , дистиллированной воды в колбе данного объема.

9.1.3. Раствор элюента готовят смешиванием с помощью мерного цилиндра 475 0,02 М раствора дигидрофосфата калия и 25 ацетонитрила. Раствор доводят до рН 3 ортофосфорной кислотой. Непосредственно перед измерением раствор фильтруют с помощью набора для фильтрации растворов.

9.2. Подготовка прибора

Общую подготовку прибора осуществляют согласно инструкции по эксплуатации.

9.3. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость величины хроматографического сигнала от массы анализируемого вещества в хроматографируемом объеме пробы, устанавливают по методу абсолютной градуировки с использованием серии градуировочных растворов, которые готовят разбавлением стандартного раствора N 1 в мерных колбах вместимостью 25 согласно табл. 1. Растворы устойчивы в течение недели при хранении в холодильнике.

Растворы помещают в пробоотборное устройство хроматографа.

Условия хроматографирования градуировочных смесей и анализируемых проб:

состав элюента: ацетонитрил-0,02 М дигидрофосфат калия 95:5, рН 3;

скорость потока элюента 100 ;

объем вводимой пробы 5 ;

длина волны спектрофотометрического детектора 250 нм;

время удерживания кокарбоксилазы 2 мин.

На полученной хроматограмме измеряют площади пиков, с помощью интегратора хроматографа (в условных единицах) при анализе 6 растворов разных концентраций и холостой пробы, проводя не менее 5 параллельных определений для каждого раствора, и строят градуировочную зависимость площади пика от количества компонента в пробе (мкг)

Проверку градуировочной характеристики проводят при изменении условий анализа, но не реже 1 раза в неделю

Таблица 1

Растворы для установления градуировочной характеристики при определении кокарбоксилазы

N стандарта	Стандартный раствор кокарбоксилазы,	Раствор элюента,	Концентрация вещества,	Содержание вещества в хроматографируемом объеме пробы, мкг
1	0	20	0	0
2	1,00	19,00	4	0,02
3	2,00	18,00	8	0,04
4	3,75	16,25	15	0,075
5	5,00	15,00	20	0,10
6	10,00	10,00	40	0,20
7	20,00	0	80	0,40

9.4. Отбор пробы воздуха

Воздух с объемным расходом 20 аспирируют через фильтр АФА-ВП. Для измерений 1/2 ПДК достаточно отобрать 400 воздуха. Пробы можно хранить в течение трех суток

10. Выполнение измерения

Фильтр с отобранной пробой помещают в бюкс с пришлифованной крышкой и приливают пипеткой 7,5 раствора элюента. Периодически встряхивая, выдерживают раствор в течение 5 мин и сливают его в пробирку с пришлифованной пробкой, фильтр отжимают стеклянной палочкой. Повторяют экстракцию и объединяют растворы. Хроматографирование раствора пробы проводят в тех же условиях, что и хроматографирование градуировочных растворов. Количественное определение содержания анализируемого вещества в растворе проводят по предварительно построенной градуировочной характеристике.

11. Расчет концентрации

Массовую концентрацию кокарбоксилазы (С, ) в воздухе вычисляют по формуле:

, где

а - содержание вещества в анализируемом объеме пробы, найденное по градуировочной характеристике, мкг;

б - объем пробы, взятой для хроматографирования, ;

в - общий объем раствора пробы, ;

V - объем воздуха, отобранного для анализа и приведенного к стандартным условиям, (см. прилож. 1).

12. Оформление результата анализа

Результат количественного анализа представляют в виде () , Р = 0,95, где - характеристика погрешности, .

13. Контроль погрешности методики

13.1. Метрологическая аттестация методики

Значения характеристики погрешности, норматива оперативного контроля точности и норматива оперативного контроля воспроизводимости приведены в табл. 2 в виде зависимости от значения массовой концентрации анализируемого компонента в пробе С.

Таблица 2

Результаты метрологической аттестации методики количественного химического анализа

Диапазон определяемых массовых концентраций кокарбоксилазы,	Наименование метрологической характеристики
	характеристика погрешности (), , Р = 0,95	норматив оперативного контроля точности (К), , Р = 0,90, m = 2	норматив оперативного контроля воспроизводимости (D), ; Р = 0,95, m = 2
От 0,15 до 3,00	0,17С + 0,002	0,16C + 0,002	0,15С + 0,002

ГАРАНТ:

Нумерация подразделов приводится в соответствии с источником

13.1. Оперативный контроль воспроизводимости

Оперативный контроль воспроизводимости выполняют в одной серии с анализом рабочих проб. Отбирают реальные пробы воздуха рабочей зоны из одного традиционного места отбора двумя пробоотборниками одновременно. Анализируют в соответствии с прописью методики, привлекая различных аналитиков и максимально варьируя условия проведения анализа: партии реактивов, наборы мерной посуды и т.д., и получают два результата и анализов. Результаты анализа не должны отличаться друг от друга на величину большую, чем норматив оперативного контроля воспроизводимости D:

При превышении расхождения между двумя результатами норматива оперативного контроля воспроизводимости эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

Внутренний оперативный контроль воспроизводимости проводят не реже, чем 1 раз в месяц.

13.2. Оперативный контроль точности

Оперативный контроль точности выполняют в одной серии с анализом рабочих проб. Отбирают реальные пробы воздуха рабочей зоны из одного традиционного места отбора двумя пробоотборниками одновременно. Затем к одной пробе, отобранной на фильтр, добавляют анализируемый компонент из раствора, нанося его на фильтр. Величина добавки должна соответствовать 50-150% от содержания компонента в пробе. Величина не должна выходить за верхнюю границу диапазона измерения. Результаты анализа без добавки и с добавкой получают по возможности в одинаковых условиях: одним аналитиком, с одной партией реактивов и одним набором посуды и т.д. Погрешность процедуры отбора проб контролируют путем поверки используемых пробоотборников. Расчет норматива оперативного контроля погрешности К проводят по характеристике погрешности методики за вычетом характеристики погрешности пробоотборника. Решение об удовлетворительной погрешности принимают при выполнении условия:

Внутренний оперативный контроль точности проводят не реже, чем 1 раз в месяц

14. Нормы затрат времени на анализ

Для проведения серии анализов из 6 проб требуется 3 ч.

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации, Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации

Г.Г. Онищенко