Методические указания МУК 4.1.1737-03 "Измерение массовых концентраций 2-[(диметиламино)метил]-пиридинил карбамата дигидрохлорида++ (аминостигмина) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 29 июня 2003 г.)

Методические указания МУК 4.1.1737-03
"Измерение массовых концентраций 2-[(диметиламино)метил]-пиридинил карбамата дигидрохлорида++ (аминостигмина) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 29 июня 2003 г.)

Дата введения: с момента утверждения

1. Область применения

Настоящие методические указания устанавливают количественный хроматографический анализ воздуха рабочей зоны на содержание аминостигмина в диапазоне массовых концентраций от 0,001 до 0,020 .

2. Характеристика вещества

2.1. Структурная формула

2.2. Эмпирическая формула .

2.3. Молекулярная масса 296,20.

2.4. Регистрационный номер CAS 67049-84-7.

2.5. Физико-химические свойства.

Аминостигмин - кристаллическое вещество белого с желтоватым оттенком цвета, без запаха, очень хорошо растворимо в воде (1:1), хорошо растворимо в метиловом и этиловом спирте (1:10), хорошо растворимо в смеси ацетонитрила и воды (элюенте), малорастворимо в эфире (1:10 000) и других органических растворителях. Коэффициент распределения в системе октанол - водный буфер, рН 7,4 равен 0,18. Имеет две константы ионизации (по азоту в боковой цепи и в кольце) - 2,4 и 7,8.

Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль.

2.6. Токсикологическая характеристика.

Аминостигмин - высокотоксичное вещество с антихолинэстеразной активностью. Проникает через неповрежденные кожные покровы в количестве, вызывающем смертельное отравление. Необходима защита кожи и глаз.

Класс опасности - первый. Выброс в воздух рабочей зоны запрещен. Контрольный уровень измерения - 0,001 .

3. Погрешность измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений массовых концентраций аминостигмина с погрешностью не более при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Измерения массовой концентрации аминостигмина основаны на использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением спектрофотометрического детектора при длине волны 264 нм.

Отбор проб проводится с концентрированием на фильтр.

Нижний предел измерения содержания аминостигмина в хроматографируемом объеме раствора 0,020 мкг.

Нижний предел измерения концентрации аминостигмина в воздухе 0,001 (при отборе 800 воздуха).

Метод специфичен в условиях производства готовой лекарственной формы аминостигмина. Определению не мешают сопутствующие вещества (целлюлоза микрокристаллическая, титана диоксид, поливинилпирролидон низкомолекулярный, магний стеариновокислый, оксипропилцеллюлоза).

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Хроматограф жидкостный микроколоночный типа "Милихром" со спектрофотометрическим детектором
Хроматографическая колонка стальная КАХ-44-3, 50х2 мм, заполненная сорбентом Сепарон С18, фракция 5 мкм
Весы аналитические ВЛА 200	ГОСТ 24104-88Е
Пробоотборное устройство ПУ-3Э	ГОСТ Р 51945-02
Фильтродержатель	ТУ 95.72.05-77
Пинцет медицинский	ГОСТ 21241-89
Набор для фильтрации растворов на 0,25 , производство НПФ "Биохром"
Испаритель ротационный вакуумный	ТУ 25-1173.102-84
Колбы мерные, вместимостью 100 и 500	ГОСТ 1770-74Е
Пипетки, вместимостью от 1 до 10	ГОСТ 29227-91
Цилиндр мерный со шлифом, вместимостью 100	ТУ 25.11.900-73
Бюксы 50/30	ГОСТ 25336-82Е
Колбы остродонные со шлифом, вместимостью 10	ГОСТ 25336-82Е
Фильтры АФА-ВП-10	ТУ 95-743-80

5.2. Реактивы

Аминостигмин, N регистрационного удостоверения 84/677/9, содержание основного вещества не менее 97%
Ацетонитрил "для жидкостной хроматографии"	ТУ-6-09-14-2167-84
Спирт метиловый, хч	ГОСТ 6995-77
Калий дигидрофосфат, хч	ГОСТ 4198-75
Кислота ортофосфорная, хч	ГОСТ 6552-58

Допускается применение иных средств измерения, вспомогательных устройств, реактивов и материалов, обеспечивающих показатели точности, установленные для данных методических указаний.

6. Требования безопасности

6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают меры противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-76.

6.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

7. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений и обработке результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, имеющие навыки работы на жидкостном хроматографе.

8. Условия измерений

8.1. Приготовление растворов и подготовку проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха ()°С, атмосферном давлении 84-106 кПа и относительной влажности воздуха не более 80%.

8.2. Измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9. Подготовка к выполнению измерения

9.1. Приготовление растворов

9.1.1. Стандартный раствор N 1 аминостигмина в растворе элюента концентрацией 400 готовится растворением 20 мг вещества в мерной колбе вместимостью 50 .

9.1.2. Стандартный раствор N 2 аминостигмина в растворе элюента концентрацией 40 готовится разбавлением элюентом 5 стандартного раствора N 1 в мерной колбе вместимостью 50 . Растворы устойчивы в течение месяца при хранении в холодильнике.

9.1.3. Раствор дигидрофосфата калия концентрацией 0,02 М готовят растворением 1,36 г указанной соли в 500 дистиллированной воды в колбе вместимостью 500 .

9.1.4. Раствор элюента готовят смешиванием с помощью мерного цилиндра 400 0,02 М раствора дигидрофосфата кадия и 100 ацетонитрила. Раствор доводят до рН 3 ортофосфорной кислотой. Непосредственно перед измерением раствор фильтруют с помощью набора для фильтрации растворов.

9.2. Подготовка прибора

Общую подготовку прибора осуществляют согласно инструкции по эксплуатации.

9.3. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость величины хроматографического сигнала от массы анализируемого вещества в хроматографируемом объеме пробы, устанавливают по методу абсолютной градуировки с использованием серии градуировочных растворов и холостой пробы, которые готовят разбавлением стандартного раствора N 2 согласно табл. 1. Градуировочные растворы устойчивы в течение недели при хранении в холодильнике.

Растворы помещают в пробоотборное устройство хроматографа. Условия хроматографирования градуировочных смесей и анализируемых проб:

состав элюента: ацетонитрил-0,02 М дигидрофосфат калия, 1:4, рН 3;

скорость потока элюента 100 ;

объем вводимой пробы 10 ;

длина волны спектрофотометрического детектора 264 нм;

время удерживания аминостигмина 2 мин.

На полученной хроматограмме измеряют площади пиков с помощью интегратора хроматографа (в условных единицах) при анализе 5 растворов разных концентраций и холостой пробы, проводя не менее 5 параллельных определений для каждого раствора, и строят градуировочную зависимость площади пика от количества компонента в пробе (мкг).

Таблица 1

Растворы для установления градуировочной характеристики при определении аминостигмина

N стандарта	Стандартный раствор аминостигмина N 2,	Раствор элюента,	Концентрация вещества,	Содержание вещества в хроматографируемом объеме пробы, мкг
1	0	20,0	0	0
2	1,0	19,0	2	0,02
3	2,0	18,0	4	0,04
4	3,5	16,5	7	0,07
5	5,0	15,0	10	0,10
6	10,0	10,0	20	0,20
7	20,0	0	40	0,40

Проверку градуировочной характеристики проводят при изменении условий анализа, но не реже 1 раза в неделю.

9.4. Отбор пробы воздуха

Воздух с объемным расходом 40 аспирируют через фильтр АФА-ВП Для измерения контрольного уровня содержания аминостигмина достаточно отобрать 800 воздуха. Пробы можно хранить в течение трех суток.

10. Выполнение измерения

Фильтр с отобранной пробой помещают с помощью пинцета в бюкс с пришлифованной крышкой и приливают пипеткой 5 метилового спирта. Периодически встряхивая, выдерживают раствор в течение 5 мин. Отбирают раствор пипеткой в пробирку с пришлифованной пробкой, повторяют экстракцию и объединяют растворы. Степень экстракции с фильтра - 93%. Отбирают 5 раствора, помещают в остродонную колбу со шлифом и упаривают досуха под вакуумом. Растворяют сухой остаток в 0,2 раствора элюента. Хроматографирование раствора пробы проводят в тех же условиях, что и хроматографирование градуировочных растворов. Количественное определение содержания анализируемого вещества в растворе проводят по предварительно построенной градуировочной характеристике.

11. Расчет концентрации

Массовую концентрацию аминостигмина (С, ) в воздухе вычисляют по формуле:

, где

а - содержание вещества в анализируемом объеме пробы, найденное по градуировочной характеристике, мкг;

б - объем пробы, взятой для хроматографирования, ;

в - общий объем раствора пробы после экстракции, ;

- объем жидкой пробы после растворения сухого остатка, ;

- объем жидкой пробы, взятой для упаривания, ;

V - объем воздуха, отобранного для анализа и приведенного к стандартным условиям, (см. прилож. 1).

12. Оформление результата анализа

Результат количественного анализа представляют в виде () , Р = 0,95, где - характеристика погрешности, .

13. Контроль погрешности методики

13.1. Метрологическая аттестация методики

Значения характеристики погрешности, норматива оперативного контроля погрешности и норматива оперативного контроля воспроизводимости приведены в табл. 2 в виде зависимости от значения массовой концентрации анализируемого компонента в пробе С.

Таблица 2

Результаты метрологической аттестации методики количественного химического анализа

Диапазон определяемых массовых концентраций аминостигмина,	Наименование метрологической характеристики
	характеристика погрешности (), ; P = 0,95	норматив оперативного контроля точности (К), ; Р = 0,90, m = 2	норматив оперативного контроля воспроизводимости (D), ; Р = 0,95, m = 2
от 0,001 до 0,020	0,25С + 0,0001	0,27С + 0,0002	0,25С + 0,0003

13.2. Оперативный контроль воспроизводимости

Оперативный контроль воспроизводимости выполняют в одной серии с анализом рабочих проб. Отбирают реальные пробы воздуха рабочей зоны из одного традиционного места отбора двумя пробоотборниками одновременно. Анализируют в соответствии с прописью методики, привлекая различных аналитиков и максимально варьируя условия проведения анализа: партии реактивов, наборы мерной посуды и т.д., и получают два результата и анализов. Результаты анализа не должны отличаться друг от друга на величину большую, чем норматив оперативного контроля воспроизводимости D:

При превышении расхождения между двумя результатами норматива оперативного контроля воспроизводимости эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

Внутренний оперативный контроль воспроизводимости проводят не реже, чем 1 раз в месяц.

13.3. Оперативный контроль точности

Оперативный контроль точности выполняют в одной серии, с анализом рабочих проб. Отбирают реальные пробы воздуха рабочей зоны из одного традиционного места отбора двумя пробоотборниками одновременно. Затем к одной пробе, отобранной на фильтр, добавляют анализируемый компонент из раствора, нанося его на фильтр. Величина добавки должна соответствовать 50-150% от содержания компонента в пробе. Величина не должна выходить за верхнюю границу диапазона измерения. Результаты анализа без добавки и с добавкой получают по возможности в одинаковых условиях: одним аналитиком, с одной партией реактивов, одним набором посуды и т.д. Погрешность процедуры отбора проб контролируют путем поверки используемых пробоотборников. Расчет норматива оперативного контроля погрешности К проводят по характеристике погрешности методики за вычетом характеристики погрешности пробоотборника. Решение об удовлетворительной погрешности принимают при выполнении условия:

Внутренний оперативный контроль точности проводят не реже, чем 1 раз в месяц.

14. Нормы затрат времени на анализ

Для проведения серии анализов из 6 проб при последовательном отборе проб воздуха требуется 6 ч.

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации, Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации

Г.Г. Онищенко