Приложение. Работы по исследованию штаммов микроорганизмов

Приложение

1. Приготовление взвеси и количественный учет микроорганизмов

При проведении работ по исследованию штаммов микроорганизмов (острая токсичность, постановка внутрикожных проб, изучение местного действия, изготовление диагностических аллергенов) необходимо использовать односуточную (свежую) культуру микроба-продуцента.

Питательные среды для выращивания должны обеспечивать оптимальный рост высеваемой культуры. Полученную взвесь микроорганизмов центрифугируют не менее 2 - 3 раз в физиологическом растворе с целью удаления остатков питательной среды.

Приготовленную таким образом взвесь микроорганизмов используют для непосредственного введения животным.

Для подсчета количества микробных клеток в суспензии используют камеру Горяева-Тома или другие счетные камеры. Подсчет проводят следующим образом:

- шлифованное, плоскопараллельное покровное стекло притереть к сторонам камеры путем смещения его в противоположные стороны несколько раз. Наполнить камеру суспензией микробов. Используя объектив 8х или 40х проверить под микроскопом густоту суспензии. Если в большом квадрате более 20, а в малом более 10 клеток, развести суспензию. Подсчитать 150 - 200 клеток микроорганизма в 10 больших (или 20 маленьких) квадратах сетки, перемещая квадраты по диагонали. Учесть все клетки, лежащие в квадрате сетки, а также пересекающие верхнюю и правую стороны квадрата. Повторить процедуру еще два раза, готовя каждый раз из исследуемой суспензии новый препарат. Подсчитать за 2 раза 600 - 800 клеток. Определить количество клеток по формуле:

, где

M - число клеток в 1 мл суспензии;

a - среднее число клеток в квадрате сетки (из трех повторностей);

h - глубина камеры (указана на предметном стекле клетки, равна 0,1 или 0,2 мм);

S - площадь квадрата сетки в (в камере Горяева площадь большого квадрата равна 1/25 , площадь малого 1/400 ); 1000 = 1 мл;

n - разведение исходной суспензии.

Некоторые микроорганизмы можно подсчитать только при иммерсионном увеличении (90х). Для этого используют метод фиксированных мазков с этой целью:

- отметить простым карандашом на миллиметровой бумаге прямоугольник в 4 ;

- поместить на прямоугольник чистое, сухое обезжиренное стекло;

- нанести 0,02 или 0,05 мл суспензии микробов и каплю 0,03% водного раствора агара;

- петлей или краем покровного стекла равномерно распределить каплю по площади прямоугольника;

- подсушить мазок на воздухе, погрузить в стаканчик с 96° этанолом на 10 - 20 минут для фиксации мазка;

- окрасить мазок раствором фуксина Циля или генцианвиолета, нанеся несколько капель краски на поверхность мазка;

- через 1 - 2 минуты промыть мазок, последовательно погружая стекло в 4 - 5 стаканов с водой;

- высушить мазок на воздухе и подсчитать клетки с помощью окулярной сетки, которую для этого следует поместить в окуляр между собирательной и глазной линзой;

- подсчитать 150 - 200 клеток микроорганизма в 10 больших (или 20 маленьких) квадратах сетки, перемещая квадраты по диагонали. Учесть все клетки, лежащие в квадрате сетки, а также пересекающую верхнюю и правую стороны квадрата. Повторить процедуру еще два раза, готовя каждый раз из исследуемой суспензии новый препарат. Подсчитать за 2 раза 600 - 800 клеток.

Количество микробных клеток в суспензии вычисляют по формуле:

, где

где:

M - количество клеток в 1 мл исходной суспензии;

a - среднее число клеток в квадрате окулярной сетки (или в поле зрения);

S - площадь квадрата окулярной сетки (поле зрения) в ;

v - объем нанесенной на стекло суспензии в мл;

S - площадь приготовленного мазка в ;

n - разведение суспензии.

Площадь квадрата сетки или поля зрения определяют с помощью объект-микрометра. Последний помещают на столик микроскопа и при том же увеличении, при котором проводят подсчет, определяют сторону окулярной сетки или диаметр поля зрения. Площадь поля зрения вычисляется по формуле:

Для оценки жизнеспособных клеток необходимо приготовить раствор краски: 1) на растворе Рингера или Хенкса двойной концентрации приготовить 0,1% раствор водного эозина;

2) на дистиллированной воде приготовить 0,1% раствор трипановой синьки;

3) смешать растворы в отношении 1:1.

К капле микробной суспензии добавить 1 - 2 капли краски, смешать. Подсчитать в камере Горяева 100 клеток, среди них число окрашенных (мертвых), определить процент живых клеток.

2. Бактериологическое и гистологическое исследование внутренних органов

Приготовление микроскопических материалов проводится с соблюдением мер и режима работы в асептических условиях.

Исследуемую кровь отбирают в местах ее наибольшего скопления пипеткой в количестве 0,1 мл и моментально наносят на предметное стекло и на поверхность питательной среды, по которой она равномерно распределяется шпателем (посев способом "газона").

Внутренние органы - легкие, почки, печень, селезенка и т.д. обрабатывают спиртом или прижигают их поверхности раскаленным металлическим шпателем и разрезают стерильным скальпелем. С поверхности разреза делают отпечатки на предметные стекла. Часть органа отсекают от остальной части и фиксируют в 10 - 15% растворе формалина в течение 24 - 48 часов. Другую часть органа подвергают измельчению и растирают в стерильной ступке с 1 - 2 мл стерильного физиологического раствора. После 5 минут отстаивания полученной кашицей засевают методом "газона" на питательную среду и помещают в термостат с оптимальной для искомого микроорганизма температурой.

Для культивирования анаэробов - условия анаэробиоза в микроанаэростатах МИ-752 с остаточным давлением мм ртутного столба.

Мазки на предметных стеклах (параллельно должны быть мазки и из исходной культуры исследуемого микроорганизма) просушивают на воздухе при комнатной температуре и фиксируют одним из известных способов:

- троекратным проведением предметного стекла с мазком-отпечатком вверх над пламенем, время фиксации не более 5 - 6 секунд;

- внесением предметного стекла с мазком-отпечатком в емкость с 96° этиловым спиртом на 10 - 15 минут;

- нанесением на мазок-отпечаток 1 - 2 капель жидкости Никифорова (смесь равных объемов этилового спирта и эфира), время фиксации 20 минут.

Для количественного учета микроорганизмов препарат окрашивают различными способами в зависимости от вида искомой культуры.

Приготовление гистологического материала:

Для изготовления гистологического среза фиксированный в 10 - 15% растворе формалина в течение 24 - 48 часов материал заливают парафином по принятой в патоморфологии методике.

Для окраски микроорганизмов в гистологических срезах (синька Лефлера, по Грам-Вейгерту, Гоммори-Гроккоту) следует срез депарафинировать. Удаление парафина из среза производится ксилолом на предметное стекло, на которое наклеивается срез или серия срезов, с помощью смеси белка с глицерином (готовой из равных частей чистого свежего куриного белка и глицерина, затем смесь фильтруют, добавляют кристаллик камфоры или тимола). С этой целью каплю белка глицерина размазывают тонким слоем на предметном стекле и фламбируют над пламенем со стороны необработанной поверхности. Затем на обработанную поверхность стекла наносят каплю дистиллированной воды и располагают парафиновый срез. Избыток воды сливают, а срез плотно прижимают к стеклу несколькими слоями фильтровальной бумаги, можно - смоченной 96° спиртом.

В полученных препаратах определяют форму микробов, размеры, расположение их группами или в одиночку, цепочкой или кучками, наличие или отсутствие спор, мицелия, псевдомицелия, результаты окраски по Граму (положительные, отрицательные) и т.д.

3. Методы приготовления микробных аллергенов

Приготовление корпускулярных антигенов. В чашку Петри с агаризованной средой положить диск из целлофана, вылить 1 мл стерильного фосфатного буфера и 2 - 3 капли микробной взвеси. Тщательно растереть шпателем. Чашки поместить на одни сутки в термостат при 37°C. Затем микробную культуру смыть 1 - 5 мл физиологического раствора с 0,2 - 0,3 объемными процентами формалина. Полученную микробную взвесь проверяют на стерильность и разводят 0,25% стерильным карболовым физиологическим раствором до густоты 1 млрд. микробных клеток в мл, разливают в ампулы. Антиген проверяют на токсичность: вводят 0,5 мл внутрибрюшинно двум белым мышам и наблюдают за их состоянием в течение 7 суток. Если животные выживают, антиген считается безвредным.

Получение микробных белоксодержащих аллергенов методом щелочного экстрагирования. Микробную культуру выращивают на плотной питательной среде, смывают физиологическим раствором, центрифугируют и высушивают ацетоном. К сухой микробной массе прибавляют щелочь из расчета 50 мл 1% раствора КОН на 1 г микробов. Экстракцию проводят при комнатной температуре в течение 1 суток (периодически перемешивают). Осадок удаляют центрифугированием в течение 1 часа при 10 - 12 тысячах оборотов в минуту и температуре 5°C. Экстракт осаждают 50% раствором уксусной кислоты, а надосадочную жидкость сливают (оставив 1/4 - 1/5 часть от исходного объема). Смесь выдерживают 2 часа при температуре 5 - 8°C. Осадок отделяют центрифугированием в течение 30 минут при 4 - 6 тысячах об./мин., растворяют в физиологическом растворе (1/5 часть от исходного объема экстракта) и подщелачивают до pH 7,2 - 7,4. Подвергают диализу в течение 18 - 20 часов против водопроводной воды и 6 часов против дистиллированной воды. Проводят лиофильное высушивание. Полученный порошок запаивают в ампулы и хранят в холодильнике. Растворяя порошок в обратном буфере с pH 7,2 - 7,4, получают аллерген, который стандартизируют по содержанию белка и используют для кожных аппликационных проб.

Изготовление белоксодержащих грибковых аллергенов. Из целлофана (марки "пищевой-45") вырезают диски диаметром на 1 см больше чашки Петри и стерилизуют при 1 атмосфере 30 минут. Стерильные диски укладывают на чашки Петри со средой Чапека или сусло-агаром. На целлофан наливают 1 мл стерильного фосфатного буфера и засевают грибы. Чашки помещают в термостат (28 - 30°C) на 8 - 10 суток. Выращенные культуры грибов смывают с целлофана, фильтруют через 2 слоя стерильной марли и высушивают при 60°C в течение 72 часов (со 100 чашек получают 15 - 18 г сухого вещества).

5 г сухого вещества (спор) заливают 100 мл экстрагирующей жидкости Эвенса-Кока с этанолом (12% спирта в конечной концентрации). Жидкость Эвенса-Кока готовят из следующих компонентов: реактив N 1 - натрий хлористый 50 г, калий фосфорнокислый однозамещенный 365 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный 14,31 г, дистиллированная вода - до 1 литра; реактив N 2 - 4% раствор фенола. Равные объемы реактивов N 1 и 2 смешивают и к 1 части смеси прибавляют 4 части дистиллированной воды, pH жидкости соответствует 7,0 - 7,2.

Экстракцию проводят в банке с притертой крышкой при постоянном встряхивании в холодильнике в течение 11 суток. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр, стерилизуют, пропуская через фильтр Зейтца, разливают в ампулы. Затем проверяют на стерильность и безвредность: белым мышам или морским свинкам вводят внутривенно или внутрибрюшинно в дозах 10 мг/кг и наблюдают 30 суток. Определяют содержание общего и белкового азота по методу микро-Къельдаля.

4. Количественное определение штаммов-микроорганизмов в воздухе затравочных камер

Отбор проб воздуха из камер производится прибором Кротова с переходным приспособлением следующим образом:

- предварительно чашки Петри заливают соответствующей питательной средой на строго горизонтальном столе, наливая в каждую чашку по 15 мл питательной среды;

- по истечении времени, необходимого для отбора воздуха (проведения "посева"), чашки с "посевом" инкубируют 24 - 48 часов при температуре, соответствующей оптимальной температуре исследуемого штамма микроорганизма. Чашки просматривают и подсчитывают общее количество выросших, идентичных исследуемому штамму, колоний. Зная количество воздуха, проходящего через прибор в минуту, и время экспозиции, определяют общий объем воздуха, из которого произведен высев. По количеству выросших в чашке Петри колоний определяют концентрацию микроорганизмов в 1 воздуха.

Пример подсчета:

Через прибор пропущено 60 л воздуха в течение 2 мин., число выросших колоний - 120, тогда количество микроорганизмов в 1 куб. м воздуха будет равно:

5. Определение способности микроорганизмов проникать в кровь из дыхательных путей

Для определения способности изучаемого микроорганизма проникать в кровь из дыхательных путей у каждого животного (не менее 12) берут по 2 капли крови из хвостовой артерии через час после окончания экспозиции и через сутки. Полученную кровь наносят на твердые или жидкие питательные среды. Методы посева и подсчета микроорганизмов описаны выше.

6. Регистрация паранекротических изменений в легких

После постановки кожных проб (у тех же животных) о развитии паранекротических изменений в легких судят по способности ткани легкого фиксировать краситель.

Морским свинкам, крысам внутрисердечно вводят нейтральный краситель в количестве 0,2 мл на 100 г массы тела. Раствор 1% нейтрального красителя приготавливается на физиологическом растворе перед употреблением. Краска подогревается до 100°C в течение 30 мин. Время введения краски отмечается по секундомеру. Животные забиваются пересечением позвоночника со стороны спины, чтобы не повредить трахею и исключить попадание крови в легкие, через 1 и 10 мин. после инъекции. После забоя животных вскрывают и извлекают легкие; 500 мг ткани легкого погружают в герметично закрытый бюкс, содержащий 5 мл 1% солянокислого спирта. Кусочек легкого измельчают в бюксе кончиками острых ножниц, через 24 часа раствор сливают в центрифужные пробирки и центрифугируют. Определение количества красителя производят на ФЭКе при зеленом светофильтре (546 - 550 нм).