Методические указания "Постановка исследований для обоснования предельно допустимых концентраций производственных штаммов микроорганизмов и на их основе готовых форм препаратов в воздухе рабочей зоны" (утв. Главным государственным санитарным врачом СССР 23 декабря 1983 г. N 2955-83)

Методические указания
"Постановка исследований для обоснования предельно-допустимых концентраций производственных штаммов микроорганизмов и на их основе готовых форм препаратов в воздухе рабочей зоны"
(утв. Главным государственным санитарным врачом СССР 23 декабря 1983 г. N 2955-83)

ГАРАНТ:

Настоящие Методические указания признаны утратившими силу в связи с изданием Методических указаний по экспериментальному обоснованию ПДК микроорганизмов-продуцентов и содержащих их готовых форм препаратов в объектах производственной и окружающей среды, утвержденными Главным санитарно-профилактическим Управлением Минздрава СССР 11 июня 1991 г. N 5789/1-91

Общие положения

Настоящие Методические указания предназначены для специалистов научно-исследовательских учреждений, занимающиеся изучением и обоснованием санитарных нормативов для производственных штаммов микроорганизмов и на их основе готовых форм препаратов в воздухе рабочей зоны.

В производствах микробиологического синтеза широко используются разнообразные микроорганизмы: дрожжеподобные и плесневые грибы, бактерии, с помощью которых получают белково-витаминные концентраты, аминокислоты, витамины, ферментные и другие препараты.

Разработка настоящих Методических указаний обусловлена расширяющимся промышленным применением микроорганизмов в различных отраслях народного хозяйства нашей страны и возникшей проблемой гигиенического регламентирования их содержания в воздухе рабочей зоны.

Настоящие методические указания должны способствовать получению однородных и сравниваемых материалов, выбору оптимального объема исследований, необходимых для обоснования санитарных стандартов предельно допустимых концентраций для производственных штаммов микроорганизмов и на их основе готовых форм препаратов.

Регламентированию подлежат штаммы микроорганизмов, допущенные к использованию в технологических процессах микробиологического синтеза.

Последовательность проведения исследований, их объем, рекомендуемые методы и питательные среды, являясь обязательными, не должны связывать творческой инициативы научных коллективов и отдельных специалистов в плане расширения, углубления, привлечения и использования дополнительных и новых методов исследования при обосновании нормативов на промышленные микроорганизмы.

При направлении для исследования производственных штаммов микроорганизмов с целью обоснования их ПДК в воздухе рабочей зоны обязательно указывается полное наименование микроорганизма и его таксономическое положение, представляются сведения об условиях культивирования и областях применения. Если имеется наполнитель, то указывается какой, его дисперсность и какое количество микроорганизмов находится в 1 г готового продукта.

Исследования проводят на следующих видах животных: белые мыши (масса тела 18 - 24 г), белые крысы (масса тела 180 - 240 г), морские свинки (масса тела 200 - 250) и кролики (масса тела 1500 - 2000 г). При этом указывают вид, линию (популяцию), пол, исходную массу тела, пищевой рацион, сезон, в который производилась каждая серия экспериментов. Могут быть использованы и другие модели, применяемые в микробиологии: культура клеток, куриные эмбрионы и т.п. Выбор модели должен быть аргументирован.

Качество лабораторных животных должно соответствовать требованиям, изложенным в IX разделе Методических указаний "К постановке исследований для обоснования санитарных стандартов вредных веществ в воздухе рабочей зоны" (М., 1980); условия содержания - требованиям "Санитарных правил по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)", (М., 1973).

Гигиеническому нормированию могут подвергаться не только отдельные штаммы микроорганизмов, но и группы штаммов, имеющие таксономическое родство и обладающие сходными показателями вирулентности. В таком случае проводится предварительный отбор группы штаммов микроорганизмов, подлежащих нормированию, т.е. выделение групповых репрезентативных штаммов, которые являются типичными представителями данной группы микроорганизмов. Групповые репрезентативные штаммы исследуются по полной схеме, а остальные представители такой группы исследуют только в остром опыте.

Способы воздействия и методы исследования

1. Определение средневирулентной дозы

Определение средневирулентной дозы, т.е. дозы, которая вызывает смертельный эффект у 50% подопытных животных, проводят путем введения взвеси штаммов микроорганизмов (, , , , и клеток на одно животное) внутрибрюшинно и в желудок. На каждую дозу используют не менее 12 мышей и 12 крыс (по 6 самок и 6 самцов), и проводят наблюдение за их выживаемостью и общим состоянием в течение 30 суток. Расчет средневирулентной дозы проводят статистическим методом.

2. Определение диссеминации штаммов микроорганизмов во внутренних органах подопытных животных

С целью определения диссеминации во внутренних органах изучаемыми штаммами используют животных, оставшихся в живых от дозы с наибольшим числом введенных микроорганизмов. Время забора материала - через 12, 72 часа и месяц после введения культуры микроорганизма. На каждый срок контроля забивают не менее 6 животных (3 самца и 3 самки). Посевы делают из крови и отпечатки легких, сердца, печени, селезенки и почек. Посевы делают до прекращения обнаружения культуры микроорганизмов, но не более 1-го месяца.

3. Изучение способности штаммов микроорганизмов повреждать конъюнктивальную оболочку глаза

Повреждающее действие штаммов микроорганизмов при их местном воздействии изучают на конъюнктивальной оболочке глаз кролика в два этапа:

а) воспалительное действие штаммов микроорганизмов;

б) раздражающее действие готовых форм препарата.

Для проведения опыта берут не менее 3-х кроликов на каждый этап исследования. Из взвеси, в 1 мл которой находится клеток микроорганизмов, закапывают 1 каплю в конъюнктивальный мешок глаза. Внесение капли производят однократно. Учет эффекта проводят в соответствии с "Методическими указаниями к постановке исследований по изучению раздражающих свойств и обоснованию ПДК избирательно действующих раздражающих веществ в воздухе рабочей зоны" (N 2196-80 от 11.08.80).

В случае обнаружения местного действия на конъюнктиву глаза проводят исследование раздражающих или воспалительных свойств штаммов микроорганизмов с целью установления недействующего количества (концентрации) микроорганизмов или готовых препаратов на их основе.

4. Установление порога острого ингаляционного действия

Исследования проводят на наиболее чувствительных животных по результатам определения средневирулентной дозы при однократной четырехчасовой экспозиции. Минимальная группа животных - 12 особей. Обследование животных проводят через сутки после окончания затравки. В качестве показателей интоксикации используются интегральные (общее состояние, ректальная температура тела) и специфические показатели, характеризующие состояние организма (миграции клеточных элементов на поверхность слизистой оболочки верхних дыхательных путей и легких, способность изучаемого микроорганизма проникать в кровь из дыхательных путей, паранекротические изменения в легких).

5. Определение среднеаллергенной дозы

Установление среднеаллергенной дозы проводят при изучении сенсибилизирующей активности штаммов микроорганизмов или готовых форм препаратов, получаемых на их основе. Выраженность сенсибилизирующей активности учитывают по - среднеаллергенной дозе, под которой понимается средняя эффективная доза, вызывающая изучаемый эффект у 50% животных. Определение среднеаллергенной дозы проводят следующим образом. Вначале в кожу наружной поверхности уха морской свинки (не менее 12 животных) в 0,02 мл физиологического раствора вводят микроорганизмы в дозах , , и на одно животное. Контрольным животным вводят 0,02 мл физиологического раствора.

Через 10 суток после введения микроорганизмов в кожу наружной поверхности уха ставят внутрикожно пробы с аллергенами, которые вводят в кожу боковой поверхности туловища подопытных морских свинок в объеме 0,1 мл. Контрольным животным вводят в том же объеме растворитель, используемый для приготовления аллергена. Реакцию учитывают через 24 часа по диаметру эритемы и оценке инфильтрата или отека.

Реакцию оценивают в баллах:

1 балл - эритема;

2 балла - эритема и небольшой отек;

3 балла - выраженная инфильтрация;

4 балла - появление некроза.

Если введение контрольного физиологического раствора вызывает видимую реакцию кожи в те же сроки наблюдения, то аналогичные ей реакции на введение микроорганизмов оценивают как отрицательные.

Подбор разрешающей дозы для тестирования осуществляется однократным внутрикожным введением аллергена 5 - 6 интактным морским свинкам альбиносам. Для тестирования выбирают максимальное количество микроорганизмов, не вызвавших реакцию кожи через 24 часа после введения.

Метод гистаминовой провокации применяется в том случае, если внутрикожные пробы дали сомнительные результаты. С этой целью подопытным и контрольным животным внутрибрюшинно вводят дозу гистамина из расчета 0,03 мг/кг совместно с разрешающей дозой аллергена. Реакцию учитывают через 20 - 40 минут по гибели животных или характерным признакам сенсибилизации (почесывание лапками мордочки, почихивание, озноб и т.д.).

Полученные результаты рассчитывают статистическим методом, устанавливая при этом . В качестве альтернативного учета реакции предлагается наличие или отсутствие кожных реакций, при тестировании методом гистаминовой провокации эффект учитывается по гибели животных или характерным признакам сенсибилизации.

6. Определение опасности в условиях повторного ингаляционного воздействия штаммами микроорганизмов или готовыми формами препаратов на их основе

Эксперимент по определению опасности в условиях повторного ингаляционного воздействия штаммами микроорганизмов проводят в течение 4-х месяцев, при экспозиции 4 часа в день, 5 раз в неделю на морских свинках. Для установления среднеаллергенной концентрации и порога аллергенного действия при ингаляционном воздействии (через 1 месяц после начала опыта) отбирают не менее 12 животных, которым внутрикожно вводят разрешающую пробу. В случае неэффективности разрешающей пробы используют метод гистаминовой провокации.

Из иммунологических методов оценки сенсибилизации рекомендуются реакция специфического лизиса лейкоцитов, реакция специфической агломерации лейкоцитов, а для определения гуморальных антител - реакция специфической микропреципитации.

Для возможности установления диссеминации микроорганизмов во внутренних органах морские свинки, находящиеся в хроническом эксперименте, обследуются через 3 суток первого, второго, третьего и четвертого месяцев после начала ингаляции. Обследование проводят и после окончания восстановительного периода.

В случае развития дисбактериоза под влиянием изучаемого микроорганизма проводят бактериологическое исследование испражнений, взятых из толстого кишечника животного. При этом в фекалиях определяют количество кишечных палочек (посев на среду Эндо), количество гемолитических бактерий (посев на 5% кровяной агар), энтерококков (на среде с ТТХ), стафилококков (посев на дрожжевой агар солевой - ДСА), грибов (на среде Сабуро), бактериоидов (на среде КАБ), лактобацилл (на среде Ленцнера), протея (посев на бульон с мочевиной).

Все посевы на аэробы инкубируют 24 - 48 часов при 37°C, посевы на анаэробы инкубируют 24 - 48 часов в атмосфере углекислого газа при 37°C. Определяют количество микроорганизмов в 1 г фекалий.

Наименьшее количество (концентрация) микроорганизмов, вызвавшее дисбактериоз, считается пороговой концентрацией при ингаляционном воздействии.

В те же сроки, когда проводится забой животных с целью определения диссеминации во внутренних органах, животных предварительно обследуют, используя интегральные показатели, характеризующие общее состояние (температура и масса тела, частота сердечных сокращений и другие). Из специфических показателей используют исследования, рекомендованные в пункте 4 настоящих указаний, при установлении порога острого ингаляционного действия.

7. Морфологические исследования внутренних органов подопытных животных

Морфологические исследования внутренних органов подопытных и контрольных животных проводят по общепринятым методам с учетом воздействия микроорганизмов, обязательно при выполнении пунктов 1 и 6 настоящих Методических указаний.

8. Обоснование предельно допустимой концентрации производственных штаммов микроорганизмов или готовых форм препаратов на их основе

После получения результатов исследования и установления пороговых уровней, рассчитывается предельно допустимая концентрация как отношение пороговой концентрации по лимитирующему эффекту к коэффициенту запаса. Коэффициент запаса выбирается с учетом всех установленных показателей опасности, но не менее 10.

Класс опасности для штаммов микроорганизмов устанавливается в соответствии с классификацией штаммов микроорганизмов по степени опасности.

Классификация
штаммов микроорганизмов по степени опасности

Наименование показателя	Ед. измерения	Нормы для класса опасности
		1-го	2-го	3-го	4-го
Средняя вирулентная доза:	клеток на одно животное
при введении и желудок		до	от до	от до	более
при введении внутрибрюшинно		до	от до	от до	более
Средняя аллергенная доза по сенсибилизирующему эффекту	клеток на одно животное	до	от до	от до	более
Порог аллергенного ингаляционного действия		до	от до	от до	более
Порог хронического ингаляционного действия		до	от до	от до	более
ПДК штаммов микроорганизмов в воздухе рабочей зоны		до 200	от 200 до 2000	от 2000 до 20000	более 20000

1-й класс - чрезвычайно опасные, обладают выраженным общетоксическим или аллергенным действием;

2-й класс - высокоопасные, могут оказывать сильное аллергенное и общетоксическое действие;

3-й класс - умеренные, обладают слабым общетоксическим или аллергенным действием;

4-й класс - малоопасные, практически не обладают аллергенным и общетоксическим действием.