4.2. Методы контроля. биологические и микробиологические факторы
Методические указания
МУК 4.2.3019-12
"Организация и проведение лабораторных исследований на иерсиниозы на территориальном, региональном и федеральном уровнях"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 18 июня 2012 г.)
Дата введения: с момента утверждения
Введены впервые
1. Область применения
1.1. Настоящие методические указания (далее - МУ) определяют организацию и порядок проведения исследований на иерсиниозы в лабораториях территориального, регионального и федерального уровней.
1.2. МУ предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы медицинскими и другими организациями, независимо от организационно-правовой формы и формы собственности.
2. Нормативные и методические документы
В настоящих методических указаниях использованы ссылки и положения следующих нормативных и методических документов:
2.1. Федеральный закон от 03.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".
По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Дату Федерального закона следует читать как "от 30.03.1999 г."
2.2. Постановление Правительства Российской Федерации от 16.04.2012 N 317 "О лицензировании деятельности в области использования возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных (за исключением случая, если указанная деятельность осуществляется в медицинских целях) и генно-инженерно-модифицированных организмов III - IV степени потенциальной опасности, осуществляемой в замкнутых системах".
2.3. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 24.02.2009 N 11 "О представлении внеочередных донесений о чрезвычайных ситуациях в области общественного здравоохранения санитарно-эпидемиологического характера".
2.4. Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 7.07.2009 N 415н "Об утверждении квалификационных требований к специалистам с высшим и послевузовским медицинским и фармацевтическим образованием в сфере здравоохранения".
2.5. Приказ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 17.03.2008 N 88 "О мерах по совершенствованию мониторинга за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней".
2.6. СанПиН 2.1.7.2790-10 "Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами".
2.7. СП 1.3.1318-03 "Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I - IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами".
2.8. СП 1.3.2322-08 "Санитарно-эпидемиологические правила "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".
2.9. СП 1.3.2518-09. "Санитарно-эпидемиологические правила "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. Дополнения и изменения N 1 к СП 1.3.2322-08".
2.10. МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности".
2.11. МУК 4.2.2316-08 "Методы контроля бактериологических питательных сред".
2.12. МУ 3.1.2438-09 "Эпидемиологический надзор и профилактика псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза".
2.13. МУК 4.2.2746-10 "Порядок применения молекулярно-генетических методов при обследовании очагов острых инфекций с групповой заболеваемостью".
2.14. СП 3.1.7.2615-10 "Профилактика иерсиниозов".
3. Перечень сокращений
БХ - бульон Хоттингера
ЗФР - забуференный физиологический раствор
ИФА - иммуноферментный анализ
ЛПО - лечебно-профилактические организации
МО - медицинские организации
ОРА - ориентировочная реакция агглютинации
ПУС - полиуглеводная среда
ПК - пептонно-калиевая среда
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РА - реакция агглютинации
РНГА - реакция непрямой гемагглютинации
СанПиН - санитарные правила и нормы
СБТС - среда с бромтимоловым синим
СП - санитарно-эпидемиологические правила
УСС - универсальный скошенный столбик
4. Общие положения
Yersinia pseudotuberculosis (возбудитель псевдотуберкулеза) и Yersinia enterocolitica (возбудитель кишечного иерсиниоза) - энтеропатогенные иерсинии, относимые к возбудителям зооантропонозных инфекций. Заражение Y. pseudotuberculosis происходит через инфицированные продукты питания (преимущественно овощи), Y. enterocolitica - чаще при употреблении в пищу молочных и мясных продуктов.
Иерсиниозы широко распространены в мире. В ряде стран Европы кишечный иерсиниоз занимает третье место по заболеваемости среди кишечных инфекций, после кампилобактериоза и сальмонеллеза. Заболеваемость псевдотуберкулезом в Российской Федерации регистрируется практически повсеместно, преимущественно в виде вспышек, кишечным иерсиниозом - в виде спорадических случаев.
Характеристика иерсиний
Род Yersinia включает группу грамотрицательных, не образующих спор, палочковидных (кокки или овоиды) факультативно-анаэробных микроорганизмов, относящихся к семейству Enterobacteriaceae. Среди 17 видов, входящих в род Yersinia, три отнесены к патогенным для человека и животных - возбудитель чумы Y. pestis, возбудитель псевдотуберкулеза Y. pseudotuberculosis и 11 представителей вида Y. enterocolitica патогенных биотипов 1 В и 2-5.
Y. enterocolitica биотипа 1А относят к непатогенным, однако они могут быть возбудителями оппортунистических инфекций. Также непатогенными являются 13 видов иерсиний: Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii, Y. rohdei, Y. ruckeri, Y. aleksiciae, Y. similis. Y. massiliensis, Y. nurmii, Y. pekkanenii, Y. entomophaga.
Основные биохимические свойства Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica и некоторых других представителей Enterobacteriaceae, которые используются в практической работе при первичном изучении выделенных культур, представлены в табл. 1 и 2.
По О-антигену известен 21 серотип Y. pseudotuberculosis. Среди Y. enterocolitica различают 6 биотипов и 30 серотипов, из них 9 наиболее часто ассоциируются с заболеваниями человека: 0:3; 0:4: 0:5,27; 0:9; 0:8; 0:13; 0:18; 0:20: 0:21 (табл. 3).
Антигенное родство (по О-антигену) Y. pseudotuberculosis и большинства серотипов У. enterocolitica выражено слабо. Значительное сходство по антигенной структуре выявлено у Y. pseudotuberculosis серотипа 0:1 и Y. enterocolitica "американских" серотипов 0:8; 0:18 и 0:21.
Таблица 1
Основные дифференциальные признаки Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica и других представителей семейства Enterobacteriaceae
Признаки |
Y. pseudotuberculosis |
Y. enterocolitica |
Shigella spp |
Salmonella spp |
Escherichia spp. |
Proteus spp. |
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
|
Рост на универсальном скошенном столбике (УСС) |
Окраска столбика среды |
Малиновый |
Желтый, по уколу черно-бурая полоска |
Желтый |
Желтый или черный + газ |
Желтый + газ |
Малиновый |
Окраска скошенной поверхности среды |
Малиновая |
Желтая |
Красная |
Красная |
Желтая |
Желтая или малиновая верх черный |
|
Рост на трехсахарном агаре с мочевиной (среде И.С. Олькеницкого) |
Окраска столбика среды |
Малиновый (через 20 ч Желтый) |
Малиновый (через 20 ч Желтый) |
Желтый |
Желтый или черный + газ |
Желтый - газ |
Малиновый или черный |
Окраска скошенной поверхности среды |
Малиновая |
Малиновая |
Красная |
Красная |
Желтая |
Малиновая |
|
Рост на трехсахарном агаре с мочевиной (среде Ресселя I) |
Окраска столбика среды |
Малиновый со дна пробирки |
Малиновый со дна пробирки |
Желтый/ зеленый |
Желтый + газ |
Желтый + газ |
Малиновый, + газ |
Окраска скошенной поверхности среды |
Сиреневая |
Сиреневая |
Сиреневая |
Сиреневая |
Желтый/ зеленый |
Сиреневая |
|
Рост на трехсахарном агаре с сахарозой и маннитом (среде Ресселя II) |
Окраска столбика среды |
Желтый |
Желтый, газ |
Желтый/ Красный |
Желтый, почернение по уколу |
Желтый, +/- газ |
Желтый/ Красный, почернение по уколу |
Окраска скошенной поверхности среды |
Малиновая |
Желтая |
Желтая |
Желтая/ Красная |
Желтая/ Красная |
Желтая/ Красная |
|
Ферментация углеводов |
Сахароза |
- |
+ |
- |
- |
X |
X |
Рамноза |
- |
- |
-/+ |
+ |
+/- |
-/+ |
|
Раффиноза |
-/+ |
- |
-/+ |
- |
X |
-/+ |
|
Маннит |
+ |
+ |
+/- |
+ |
+ |
-/+ |
|
Сорбит |
- |
+ |
+/- |
+ |
+/- |
- |
|
Наличие орнитиндекарбоксилазы |
|
- |
+ |
-/+ |
+ |
X |
-/+ |
Утилизация цитрата |
|
- |
- |
- |
+/- |
|
+ |
Дезаминирование фенилаланина |
|
- |
- |
- |
- |
|
ч- |
Реакция Фогес-Проскауэра |
|
- |
- |
- |
- |
- |
-/+ |
Примечание: "+" - положительная реакция: "-" - отрицательная реакция; "+/-" - большинство штаммов позитивно, но некоторые негативно: "-/+" - большинство культур негативно, некоторые штаммы позитивны: "х" - разные реакции |
Таблица 2
Основные биохимические свойства бактерий рода Yersinia (26+-2)
Тест или субстрат |
Y. peslis |
Y. pseudotuberculosis |
Y. enterocolitica |
|
Y. frederiksenii |
Y. intermedia |
Y. krisicnsenii |
Y. ruckeri |
Y. aldovae |
Y. rohdei |
Y. mollaretti |
Y. bercovieri |
Y. alcksiciae |
Y. similis |
|||||
Биотипы |
|
||||||||||||||||||
I |
II |
III |
IV |
V |
|||||||||||||||
IA |
IB |
|
|
|
|
||||||||||||||
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
14 |
15 |
16 |
17 |
18 |
19 |
|
Гидролиз мочевины |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
[+] |
[+] |
[+] |
- |
[+] |
В |
[-] |
В |
+ |
+ |
|
Образование индола |
- |
- |
+ |
+ |
В |
- |
- |
- |
+ |
+ |
В |
- |
- |
- |
|
- |
+ |
- |
|
Подвижность |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
В |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
||
Реакция Фогеса-Проскауэра |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
|
- |
- |
|
|
|
- |
- |
|
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
||
Фенилаланиндезаминаза |
- |
- |
|
|
|
- |
- |
|
- |
- |
|
|
|
- |
- |
- |
- |
- |
|
Орнитиндекарбоксилаза |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
В |
+ |
+ |
+ |
+ |
В |
[-] |
[+] |
[+] |
+ |
- |
|
Лизиндекарбоксилаза |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
В |
- |
- |
- |
- |
+ |
- |
|
Липаза (Твин-80) |
- |
- |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
В |
В |
В |
В |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
Цитрат Симмонса |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
В |
+ |
- |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
+ |
|
Гидролиз эскулина |
В |
+ |
[+] |
- |
- |
- |
- |
|
[+] |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
[-] |
- |
+ |
|
Образование кислоты из: |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
D-ксилозы |
[+] |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
В |
+ |
+ |
[+] |
- |
В |
В |
В |
+ |
+ |
+ |
|
мальтозы |
[+] |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
В |
+ |
+ |
+ |
|
мелибиозы |
[-] |
В |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
[+] |
- |
- |
- |
В |
- |
- |
- |
- |
|
L-рамнозы |
- |
В |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
+ |
|
рафинозы |
- |
[-] |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
В |
В |
- |
- |
- |
В |
- |
- |
- |
- |
|
салицина |
В |
[-] |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
+ |
+ |
[-] |
- |
- |
- |
[-] |
[-] |
- |
- |
|
сахарозы |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
В |
+ |
+ |
- |
- |
[-] |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
|
D-сорбитола |
В |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
В |
В |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
|
трегалозы |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
[+] |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
"+" - положительная реакция у 90% и более штаммов; "[+]" - положительная реакция у 76 - 89% штаммов: "В" - положительная реакция у 26-75% штаммов: "[-]" - положительная реакция у 11 - 25% штаммов: "-" - отрицательная реакция у 90% и более штаммов |
Таблица 3
Био- и серотипы У. enterocolitica и их связь с патогенностью
Патогенные свойства |
Биотип |
Серотип |
есть |
1В |
О:8; О:4; О:13а; О:18; О:20; О:21; |
2 |
О:9; О:5,27; |
|
3 |
О:1,2,3; О:5.27; |
|
4 |
О:3; |
|
5 |
О:2.3 |
|
нет |
1A |
О:5; О:6,30; О:6,31; О:7,8; О:10; О:13,7; О:14; О:16; О:19,8; О:22; О:36; О:41,42; О:41,43; О:46; О:63; О:64; О:65; О:66; О:72 |
Температурный фактор является одним из важнейших определяющих изменчивость микробов и устойчивость их во внешней среде. Оптимальная температура для жизнедеятельности иерсиний - 28 - 30°С однако они могут, хотя и гораздо медленнее, размножаться при температуре 4 - 1°С.
Достаточно долго иерсиний выживают на различных продуктах питания и даже могут на них размножаться (например, на овощах, особенно приготовленных в виде салатов). В молоке сохраняются до 18 суток, в сливочном масле - до 145 суток, на хлебе, кондитерских изделиях - от 16 до 24 суток. Иерсинии чувствительны к высокой температуре: при 100°С погибают в течение нескольких секунд, однако при температуре 50 - 60°С способны выживать до 20 - 30 мин, переносят большие (до 10%) концентрации раствора натрия хлорида, особенно при низких температурах. На микробы губительно действует прямая солнечная радиация, чувствительны иерсинии и к высыханию. Во влажной среде и невысокой температуре (14 - 18°С) выживают длительно. Кислотность среды (при уровнях рН 3,6 - 4,0) также губительна для иерсиний. В дезинфицирующих растворах в стандартных разведениях микробы Yersinia погибают в течение 5 - 10 мин. Раствор перманганата калия в концентрации 0,5 - 0,3% вызывает гибель бактерий через 3 мин.
Патогенные Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica обладают широким набором факторов патогенности, детерминируемых хромосомными и плазмидными генами.
Способность Y. pseudotuberculosis к адгезии и инвазии в клетки эпителия кишечника зависит от экспрессии хромосомного inv-гена, кодирующего синтез белка наружной мембраны инвазина с молекулярной массой 108 кДа. Диссеминация микроба в организме хозяина связана с функционированием группы хромосомных генов, ответственных за ассимиляцию ионов железа ("остров высокой патогенности", НРI). Штаммы Y. pseudotuberculosis, содержащие HPI, редко выделяются в России (3,9%), в основном они циркулируют в Европе, Австралии, Северной Америке.
Важным фактором патогенности Y. pseudotuberculosis является синтез суперантигена (YPM), ответственного за поликлональную активацию Т-лимфоцитов и гиперпродукцию провоспалительных цитокинов. Клинически это выражается развитием синдрома токсического шока. У 98% штаммов этого вида, выделенных от больных в России, Японии, Корее, обнаруживается суперантиген, вызывающий системное поражение органов и тканей.
Патогенные Y. enterocolitica также имеют факторы патогенности, обеспечивающие им адгезивные и инвазивные свойства (ген ail).
Гены НРI не выявляются у непатогенных Y. enterocolitica биотипа 1А и у низкопатогенных штаммов биотипов 2-5, но они определяются у всех высокопатогенных штаммов биотипа 1В. Энтеротоксигенность Y. enterocolitica биотипов 1В и 2-5 связана с экспрессией хромосомного гена ystA. У непатогенных представителей биотипа 1А обнаружен ген ysiB.'
Плазмидой вирулентности иерсинии pYV 42 - 48 MDa обладают все штаммы Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica IB, 2-5 биотипов. Основная функция плазмиды pYV - нейтрализация факторов иммунитета макроорганизма.
Плазмида с молекулярной массой 82 MDa (pVM) обнаружена только у Y. pseudotuberculosis 1 серотипа. Штаммы, имеющие плазмиду pVM, вызывают более тяжелое течение псевдотуберкулеза.
5. Порядок организации и проведения лабораторных исследований на иерсиниозы для лабораторий территориального уровня
5.1. Рекомендованный порядок организации и проведения лабораторных исследований на иерсиниозы в материале от людей в лабораториях лечебно-профилактических организаций
5.1.1. Требования к лабораториям, осуществляющим исследования на иерсиниозы
Наличие разрешительных и регламентирующих работу документов
Лаборатории, которые осуществляют исследования на иерсиниозы, должны иметь разрешительные документы на этот вид деятельности согласно действующему законодательству.
Проведение исследований на всех этапах: взятие проб, их хранение, доставка в лабораторию, регистрация, порядок исследования, выдача результатов должны соответствовать требованиям действующих нормативных и методических документов.
Обеззараживание отходов должно осуществляться в соответствии с действующими нормативными и методическими документами по обращению с медицинскими отходами.
Требования к специалистам и вспомогательному персоналу, участвующим в выполнении исследований на иерсиниозы
Исследования на иерсиниозы могут выполнять специалисты не моложе 18 лет с высшим и средним медицинским образованием, имеющие допуск к работе с ПБА III - IV групп патогенности на основании приказа руководителя учреждения, окончившие курсы по специальности "Бактериология", знающие правила работы с ПБА III - IV группы патогенности. Специалисты должны проходить профессиональную переподготовку не реже одного раза в пять лет. Лица, имеющие высшее (среднее) медицинское образование должны иметь сертификат специалиста ("Бактериология"/"Лабораторное дело").
Инженерно-технический персонал, дезинфекторы и санитарки проходят специальную подготовку по месту работы в соответствии с должностными обязанностями.
Необходимый уровень подготовки специалистов лабораторий представлен в прилож. 1.
Требования к знаниям и умениям специалистов лабораторий приведены в прилож. 2.
Требования к обеспечению безопасности работы персонала
Каждая бактериологическая лаборатория должна иметь пакет нормативно-методической документации и инструкций, определяющих режим безопасной работы сотрудников с учетом характера работ, особенностей технологии, свойств микроорганизмов. Результаты проверок знаний правил техники безопасности персонала при проведении работ фиксируются в специальном журнале.
Все сотрудники должны выполнять требования по обеспечению безопасности работы с материалом, подозрительным или зараженным возбудителями инфекционных болезней III-IV групп патогенности (опасности) в соответствии с действующими нормативными документами.
Порядок организации внутреннего и внешнего контроля качества лабораторных исследований
Контроль качества исследований на иерсиниозы в лабораториях включает:
- контроль качества питательных сред, диагностических препаратов и тест-систем, дезинфицирующих средств и химических реактивов;
- своевременную поверку средств измерений, аттестацию испытательного оборудования;
- контроль качества стерилизации лабораторной посуды;
- контроль работы паровых и суховоздушных стерилизаторов;
- контроль температурного режима работы холодильников и термостатов;
- контроль работы бактерицидных ламп;
- проверку состояния воздуха производственных помещений и боксов, температурного режима, влажности;
- проверку санитарного состояния помещений, включая условия уборки, дезинфекции, контроля смывов с поверхностей и оборудования.
Результаты контроля фиксируют в специальных журналах, формулярах или других учётных документах.
Внешний контроль качества лабораторных исследований включает;
- участие в межлабораторных сличительных испытаниях (МСИ);
- участие в Федеральной системе внешней оценки качества (ФСВОК);
- приобретение шифрованных образцов для идентификации иерсиний.
Правила ведения документации
Ведение лабораторной документации, включая состояние регистрационных и рабочих журналов, осуществляют ежедневно в соответствии с требованиями действующих нормативных и методических документов.
Требования к материальным ресурсам, необходимым для выполнения исследований на иерсиниозы
Для проведения исследований на иерсиниозы в лабораториях должны быть в наличии:
- питательные среды, зарегистрированные в установленном порядке (прилож. 3 к МУ);
- диагностические препараты, тест-системы, зарегистрированные в установленном порядке (прилож. 4 к МУ);
- химические реактивы (прилож. 5 к МУ):
- приборы и оборудование (прилож. 6 к МУ):
5.1.2. Номенклатура и объем исследований
В лабораториях МО проводят:
- диагностические исследования материала от госпитализированных в стационар и амбулаторных больных с целью дифференциальной диагностики и установления этиологии заболевания при спорадической и вспышечной заболеваемости;
- исследования патолого-анатомического материала.
В лабораториях МО проводят исследования материала в следующем объеме:
1) посев на среды накопления, "холодовое обогащение" с периодическими высевами на дифференциально-диагностические среды, отсев характерных по морфологическим свойствам колоний иерсиний на ПУС;
2) идентификация и дифференциация выделенных культур до вида по морфологическим, биохимическим и антигенным свойствам, в том числе с использованием полу- или автоматизированных систем идентификации ("Vitek-2", "Mini API", "Микроб-2", "Микроб-Автомат" и др.) при наличии оборудования и тест-систем;
3) выявление антител в парных сыворотках (РА, РНГА, ИФА);
4) экспрессные методы исследования (ПЦР) - при наличии оборудования.
5.1.3. Порядок лабораторных исследований на иерсиниозы
5.1.3.1. Правила отбора и транспортирования проб клинического материала
При проведении бактериологического анализа на иерсиниозы исследуется клинический материал: испражнения, моча, кровь, мазки из зева, операционный или секционный материал: аппендицикулярные отростки, мезентериальные лимфоузлы и патологически измененные органы и ткани, сгустки крови, желчь, содержимое кишечника.
Материал от больного (подозрительного на заболевание) отбирает медицинский персонал МО немедленно при выявлении больного (подозрительного на заболевание) до начала лечения антибиотиками.
При совместном использовании бактериологического и ПЦР методов отбор материала осуществляется в одноразовую посуду.
Правила отбора материала от больных (подозрительных на заболевание):
- испражнения*(1) берут на протяжении всего периода заболевания в количестве 0,5 - 1,0 г стерильной ложечкой из судна и помещают в стерильный широкогорлый флакон с 5,0 - 10,0 мл среды накопления;
- мочу исследуют в первые 7 дней болезни, берут 20 - 30 мл средней порции утренней мочи в стерильную посуду. Осадок после центрифугирования помещают в 5,0 мл среды накопления;
- смыв из зева берут в первые 3 дня болезни натощак с задней стенки глотки и корня языка тампоном, смоченном в физиологическом растворе и помешают в 5,0 мл среды накопления;
- кровь исследуют в течение болезни на высоте лихорадки, весь лихорадочный период и в период рецидива болезни. Кровь забирают натощак в количестве 5 - 10 мл из локтевой вены с соблюдением правил асептики, выдерживают при комнатной температуре в наклонном положении (под углом 30 - 45°) до образования сгустка (30 - 40 мин), после чего сгусток отделяют от стенки, сыворотку переносят в пробирку для серологических реакций, а сгусток помещают в 5,0 мл среды накопления.
Правила отбора операционного или секционного материала:
- Аппендикулярный отросток. Стерильно ножницами измельчают 1,0 - 2,0 г пробы и помещают в 5,0 - 10,0 мл среды накопления.
- Мезентериальные лимфоузлы, другие органы и ткани. Стерильно ножницами измельчают 1,0 - 2,0 г пробы и помешают в 5,0 - 10,0 мл среды накопления.
- Желчь. В 5,0 мл среды накопления помещают 0,5 - 1,0 мл.
- Содержимое кишечника. В 5,0 мл среды накопления помещают 0,5 - 1,0 мл.
- Сгусток крови. Стерильно измельчают 0,5 - 1,0 мл пробы и помещают в 5,0 мл среды накопления.
Пробы этикетируют, обрабатывают снаружи дезинфицирующим раствором, упаковывают в полиэтиленовый пакет с застежкой-молнией, заполняют бланк направления и помещают в контейнер для транспортирования биологического материала на исследование.
Транспортирование материала в лабораторию осуществляется при температуре (4 - 12)°С в течение двух часов после взятия.
I этап исследования
(пробоподготовка и посев нативного материала)
Проводят "холодовое обогащение" исследуемого материала: внесенный в среду ПК, в ЗФР или 1%-ю пептонную воду (среды накопления) материал помещают в холодильник и выдерживают в нем до первого положительного высева на 2-3, 5-7 или 10-15 сутки.
Постановка ускоренных методов исследования нативного материала: ПЦР или ИФА для выявления антигенов иерсиний псевдотуберкулеза 1 серотипа*(2). При получении положительного результата выдают предварительный положительный ответ.
II этап исследования
(на 2 - 3 сутки от начала исследования)
Проводят высев со сред накопления (2 - 3 сутки "холодового обогащения") на плотные дифференциально-диагностические среды (СБТС, Эндо) или другие коммерческие дифференциальные среды для диагностики иерсиниозов, разрешенные к применению на территории Российской Федерации (среда Мак-Конки и др.) - петлей из верхней трети слоя среды (но не с поверхности!), не взбалтывая пробирки (!).
Для инактивации посторонней микрофлоры перед каждым высевом на плотную питательную среду проводят щелочную обработку материала 0,72%-м раствором гидроксида калия в 0,5%-м растворе хлорида натрия (30 - 60 с) или 5%-м раствором тринатрий фосфата. Посевы инкубируют при 48 ч (на среде СБТС) или (на среде Эндо) 24 ч (не более 30 ч!).
Ускоренные методы исследования материала из сред накопления (2 - 3-й сутки "холодового обогащения"): ПЦР или ИФА для выявления антигенов иерсиний псевдотуберкулеза 1 серотипа. При получении положительного результата выдают подтверждение предварительного положительного ответа и продолжают бактериологическое исследование пробы до выделения культуры. При отрицательных результатах ПЦР на этапах I - II дальнейшее бактериологическое исследование пробы прекращают.
III этап исследования
(4 - 5-е сутки от начала исследования)
Просмотр посевов на дифференциально-диагностических средах, засеянных на этапе II исследования, и учет морфологии колоний.
Проводят отбор характерных для Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica колоний на дифференциальную среду с мочевиной (среду Олькеницкого, УСС или среды Ресселя I и II)*(3) и той же колонии - на скошенные столбики (или сектора) МПА (АХ) для накопления бактериальной массы. Посевы инкубируют на средах Олькеницкого, УСС, Ресселя I при (, на МПА (АХ), среде Ресселя II - при . При наличии сложности отбора колонии на две среды возможен первичный отбор колоний на среды с мочевиной с последующим пересевом уреазо-положительных культур на МПА (АХ), среду Рессель И.
IV этап исследования
(5 - 6-е сутки от начала исследования)
Проводят идентификацию и дифференциацию уреазоположительных культур из пробирки (или чашки) с МПА, засеянных на этапе II исследования (2 - 3 сутки "холодового обогащения"):
- микроскопия мазка, окрашенного по Граму;
- тест на цитохромоксидазу;
- ферментативная активность на средах Гиса*(4) : маннитол, сахароза, рамноза, раффиноза, сорбитол, мелибиоза, салицин, ксилоза;
- реакция Фогеса-Проскауэра (среда Кларка) при и ;
- декарбоксилирование орнитина (среда Биргера-Крушинской) при :
- утилизация цитрата (среда Симмонса) при ;
- дезаминирование фенилаланина (агар с фенилаланином) при :
- образование индола (0,3% полужидкий агар) при и ;
- проба с псевдотуберкулезным фагом (агар Хоттингера, МПА) при ;
- постановка ОРА на стекле с псевдотуберкулезной и иерсиниозной сыворотками - культуры с МПА (АХ), среды Ресселя II;
- идентификация возбудителя с использованием полу- или автоматизированных систем идентификации ("Vitek-2", "Mini API", "Микроб-2", "Микроб-Автомат" или аналоги) - при наличии оборудования и тест-систем.
V этап исследования
(5 - 7-е сутки от начала исследования)
Проводят высев со сред накопления (5 - 7-е сутки "холодового обогащения") на плотные дифференциально-диагностические среды после предварительной щелочной обработки.
Проводят учет результатов биохимической идентификации и дифференциации Y. pseudotuberculosis и Y. enierocolitica, проведенных на IV этапе исследования (2 - 3-й сутки "холодового обогащения"), определяют биотип Y. enterocolitica.
Проводят реакцию агглютинации на стекле с сывороткой к вирулентным иерсиниям.
Выдача окончательного положительного ответа.
VI этап исследования
(7 - 8-с сутки от начала исследования)
Просмотр посевов на дифференциально-диагностических средах, засеянных на V этапе исследования (5 - 7-е сутки "холодового обогащения").
Проводят отбор характерных для У. pseudotuberculosis и Y. Enterocolitica колоний на дифференциальную среду с мочевиной (среду Олькеницкого, УСС или среды Ресселя I и II) и МПА (АХ).
VII этап исследования
(8 - 10-е сутки от начала исследования)
Проводят идентификацию и дифференциацию уреазоположительных культур, засеянных на VI этапе исследования (5 - 7-е сутки "холодового обогащения") по тестам, предусмотренным на IV этапе исследования.
VIII этап исследования
(9 - 11-е сутки от начала исследования)
Проводят учет результатов биохимической идентификации и дифференциации У. pseudotuberculosis и У. enterocolitica, проведенных на VII этапе исследования (5 - 7-е сутки "холодового обогащения"), определяют биотип Y. enterocolitica.
Проводят реакцию агглютинации на стекле с сывороткой к вирулентным иерсиниям.
Выдача окончательного положительного ответа.
IX этап исследования
(10-е сутки от начала исследования)
Проводят высев со сред накопления на дифференциально-диагностические среды после предварительной щелочной обработки (10-е сутки "холодового обогащения").
X этап исследования
(12-е сутки от начала исследования)
Просмотр посевов на дифференциально-диагностических средах, засеянных на IХ-м этапе исследования (10-е сутки "холодового обогащения"), отбор характерных для Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica колоний на дифференциальную среду с мочевиной (среду Олькеницкого, УСС или среды Ресселя I и II) и агар МПА (АХ).
XI этап исследования
(13-е сутки от начала исследования)
Проводят идентификацию и дифференциацию уреазоположительного изолята, засеянного на Х-м этапе исследования (10-е сутки "холодового обогащения"), по набору биохимических тестов, предусмотренных на IV-м этапе исследования.
XII этап исследования
(14-е сутки от начала исследования)
Проводят учет результатов биохимической идентификации и дифференциации Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, проведенных на ХI-м этапе исследования (10-е сутки "холодового обогащения");
Выдача окончательного положительного ответа.
Передача выделенной культуры для дальнейшей идентификации в специализированную лабораторию возможна на любом этапе исследования.
5.1.3.2. Полимеразная цепная реакция
Для выявления ДНК иерсиний используют наборы для ПЦР, зарегистрированные в установленном порядке. Постановку и учет реакции осуществляют в соответствии с инструкцией по применению. Материал для исследования отбирается в одноразовую пробирку (или контейнер) в соответствии с п. 5.1.3.1 в среду накопления ЗФР (рН 7,2 - 7,4).
Наиболее информативным для ПЦР являются испражнения и кровь в период лихорадки. Материал забирается немедленно при выявлении больного и до назначения антибиотиков (!).
Исследование проб проводят в первые сутки их получения и на 2 - 3 сутки после "холодового обогащения" в ЗФР. Непосредственно перед исследованием проводят пробоподготовку материала, используя набор для выделения ДНК.
При использовании этих методов при пробоподготовке получают препарат суммарной ДНК всех содержащихся в пробе микроорганизмов, что может вызвать ингибирование ПЦР и снижение ее чувствительности. Разработан способ подготовки проб, основанный на использовании щелочной обработки материала, при котором большая часть индигенной микрофлоры погибает и удаляется как супернатант при центрифугировании, а относительно устойчивые к щелочи иерсинии выживают (патент от 27.07.2000 N 2153671):
1. Исследуемый материал (нативный) центрифугируют при 500 - 1 000 об./мин 1,5 - 2,0 мин для осаждения грубых частиц или отстаивают 2 - 3 ч при комнатной температуре.
2. Переносят 0,2 - 0,5 мл верхней фазы (в том числе, после "холодового обогащения" в течение 2 - 3 суток) в лунки полистиролового планшета для серологических реакций и смешивают с 0,72% КОН в таком же объеме.
3. После 30 - 60 с экспозиции проводят посев материала на дифференциально-диагностические среды и сразу же в лунки планшета добавляют 0,2 - 0,5 мл БХ для прекращения действия щелочи как селективного агента.
4. Материал из лунки переносят в пробирку типа "Эппендорф" и центрифугируют на микроцентрифуге при 10 000 - 12 000 об./мин 3 - 5 мин.
5. Надосадочную жидкость удаляют, осадок дважды промывают дистиллированной водой путем центрифугирования.
6. К осадку добавляют 20 мкл деионизованной воды, прогревают 10 мин при 100°С, центрифугируют при 12 000 об./мин 2 мин. Для ПЦР используют 1 - 3 мкл надосадочной жидкости.
5.1.3.3. Иммунологические методы выявления специфических антигенов
Для выявления антигенов иерсинии используют тест-систему им-муноферментную для выявления антигенов иерсинии псевдотуберкулеза 1 серотипа.
Материал для исследования, сроки и правила его взятия аналогичны п. 5.1.3.1.
Исследование проб проводят в первые сутки их получения и затем на 3 - 5-е сутки после "холодового обогащения" в среде ПК. Непосредственно перед исследованием материал инактивируют 30 мин при , центрифугируют при 3 000 об./мин и берут для исследования надосадочную жидкость. Постановку и учет реакции осуществляют в соответствии с инструкцией по применению.
5.1.3.4. Серологическое исследование на иерсиниозы
Для исследования требуется две пробы крови, взятые в разные периоды заболевания (парные сыворотки!): 1-я неделя начала заболевания и конец 2-й, начало 3-й недели болезни.
Серологическая диагностика основывается на появлении или нарастании титра антител в течение болезни. Достоверным считается 2 - 4-кратное и выше нарастание титра антител при исследовании парных сывороток.
Реакция агглютинации (РА). Для постановки РА используют стандартные иерсиниозные антигены распространенных серотипов, представляющие собой 10 млрд взвесь иерсиний эталонных штаммов в S-форме, убитых формалином и суспендированных в 0,9%-м растворе хлорида натрия. Перед постановкой микробную взвесь разводят в 10 раз до рабочей концентрации 1 млрд/мл. Реакцию ставят методом равных объемов (0,5 мл сыворотки + 0,5 мл взвеси). Диагностический титр - 1:160.
Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Для постановки РНГА используют коммерческие эритроцитарные диагностикумы к Y. pseudotuberculosis I серотипа и Y. enlerocolitica серотипов 0:3 и 0:9, представляющие собой полисахаридные антигены иерсиний, фиксированные на поверхности формалинизированных бараньих эритроцитов. Методика постановки и учета РНГА приведена в инструкции по применению. При постановке РНГА с псевдотуберкулезным диагностикумом диагностический титр равен 1 : 100, кишечноиерсиниозными - 1:200.
Для повышения диагностической эффективности РНГА и исключения ложноположительных результатов рекомендуется соблюдать следующие правила при постановке:
1. Непосредственно перед постановкой РНГА чистые полистироловые пластины ополаскивают дистиллированной водой, а затем высушивают.
2. Накануне постановки РНГА эритроцитарный диагностикум разводят 10 мл ЗФР (рН 7,2) и помещают в холодильник на ночь (для регидратации эритроцитов). Диагностикум, используемый сразу после разведения, часто дает нечеткий результат.
3. Исследуемые сыворотки крови, разведенные ЗФР в соотношении 1:25, необходимо прогреть при 56°С в течение 30 мин для устранения неспецифических гемагглютннинов, которые могут содержаться в сыворотках крови людей.
4. Поскольку некоторые сыворотки крови человека содержат антитела к эритроцитам барана (последние используются для конструирования коммерческого диагностикума), рекомендуется предварительно перед использованием провести адсорбцию каждой сыворотки 50%-й взвесью бараньих эритроцитов (0,1 мл на 1 мл сыворотки) в течение ночи при температуре холодильника.
Иммуноферментный анализ (ИФА). Для постановки ИФА используют тест-системы "Иерсиниоз-ИФА-IgA", "Иерсиниоз-ИФА-IgM", "Иерсиниоз-ИФА-IgG", предназначенные для выявления антител классов А, М и G к возбудителям кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза. Постановку и учет реакции осуществляют в соответствии с инструкцией по применению.
5.1.4. Регистрация и оформление результатов исследования
Данные о проведении исследований (испытаний) регистрируются в учётной документации, включающей:
- направления на проведение исследований;
- журналы регистрации образцов, поступивших на исследование:
- журналы регистрации результатов исследований.
Результаты каждого исследования (испытания) оформляются по унифицированным формам.
5.2. Порядок организации и проведения лабораторных исследований на иерсиниозы в ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в муниципальном образовании (городе, административном районе) в субъекте Российской Федерации
5.2.1. Требования к лабораториям филиалов (отделений) ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в муниципальном образовании (городе, административном районе) в субъекте Российской Федерации, осуществляющим исследования на иерсиниозы
Согласно п. 5.1.1.
5.2.2. Номенклатура и объем исследований
Микробиологические лаборатории филиалов (отделений) ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в муниципальном образовании (городе, административном районе) в субъекте Российской Федерации при проведении эпидемиологического надзора в соответствии с требованиями СП 3.1.2615-10 "Профилактика иерсиниозов" осуществляют в плановом порядке:
- исследование проб с эпидемически значимых объектов ("объекты риска"): смывы с оборудования, инвентаря, овощей, пищевых продуктов в овощехранилищах, мясо- и молокоперерабатывающих предприятиях, объектах торговли продуктами растительного происхождения, пищеблоках объектов общественного питания, общеобразовательных учреждениях, детских и медицинских организациях;
- исследования продуктов животноводства, птицеводства, плодоовощной продукции в разрезе Программы производственного контроля (по согласованию);
- лабораторные исследования материала от больных (подозрительных на заболевание) - осуществляются по согласованию.
По эпидпоказаниям исследованию подлежат:
- материал от людей, находящихся в одинаковых с больными условиях по риску заражения, в эпидемических очагах при проведении эпидемиологического расследования и санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий;
- в эпидемических очагах иерсиниозов или при неблагополучной эпидемиологической ситуации:
- смывы с овощей, фруктов и других продуктов, не подвергающихся термической обработке;
- смывы с поверхности оборудования, инвентаря и тары в овощехранилищах, пищеблоках организованных коллективов, домашних очагах;
- остатки подозреваемых пищевых продуктов (салаты, сок домашнего приготовления, фляжное молоко, творог домашнего приготовления, сырое свиное мясо, субпродукты и т.д.);
- экскременты домашних и сельскохозяйственных животных, смывы с их подстилок:
- помет мелких млекопитающих;
- вода открытых водоемов и из ёмкостей для хранения.
В лабораториях филиалов (отделений) ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в муниципальном образовании (городе, административном районе) в субъекте Российской Федерации проводят диагностические исследования материала в следующем объеме:
1) посев на среды накопления, "холодовое обогащение" с периодическими высевами на дифференциально-диагностические среды, отсев характерных по морфологическим свойствам колоний иерсиний на ПУС;
2) идентификация и дифференциация выделенных культур до вида возбудителя по морфологическим, биохимическим и серологическим свойствам;
3) выявление антител в парных сыворотках (РНГА, ИФА).
5.2.3. Порядок лабораторных исследований на иерсиниозы в филиалах (отделениях) ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в муниципальном образовании (городе, административном районе) в субъекте Российской Федерации
5.2.3.1. Правила отбора и транспортирования проб из объектов окружающей среды
Отбор проб и доставку осуществляют специалисты, владеющие методами отбора проб из объектов окружающей среды филиалов (отделений) ФБУЗ "ЦГиЭ".
- Пищевые продукты. В стерильную емкость помещают 25 г каждого продукта.
- Овощи. Одним влажным стерильным тампоном делают смыв не менее чем 10 экз. каждого вида овощей на границе здоровой и загнивающей части, помещают тампон в 5,0-10,0 мл среды накопления.
- Смывы с оборудования, инвентаря, тары. Одним влажным тампоном производят смыв с одноименных поверхностей площадью каждая, тампон помещают в 5,0-10,0 мл среды накопления.
- Вода из емкостей для хранения и открытых водоемов. В стерильные флаконы забирают 1 - 2 л воды.
- Помет. Собирают стерильной палочкой 1 - 2 г и помешают в 5,0 мл среды накопления.
Пробы маркируют, обрабатывают снаружи дезинфицирующим раствором, упаковывают в полиэтиленовый пакет с застежкой-молнией, заполняют бланк-направление и помещают в контейнер для транспортирования материала для исследования. Транспортирование осуществляют при температуре 4 - 12°С в течение двух часов после забора.
5.2.3.2. Правила отбора и транспортирования проб от больных (подозрительных на заболевание) и лиц, находящихся с ними в одинаковых условиях по риску заражения.
Материал от больных (подозрительных на заболевание) и лиц, находящихся с ними в одинаковых условиях по риску заражения, забирает медицинский персонал МО немедленно при выявлении больного, до начала лечения антибиотиками.
Пробы маркируют, обрабатывают снаружи дезинфицирующим раствором, упаковывают в полиэтиленовый пакет с застежкой-молнией и вместе с бланком-направлением транспортируют при 4 - 12°С в лабораторию МО или филиал (отделение) ФБУЗ "ЦГиЭ" (по договоренности) в течение двух часов после забора.
Взятие материала осуществляют согласно п. 5.1.3.1.
5.2.3.3. Порядок проведения лабораторного исследования на иерсиниозы объектов окружающей среды и материала от людей.
Исследование проб объектов окружающей среды, исследование клинического материала на иерсиниозы, видопринадлежность выделенных культур осуществляют в соответствии с п. 5.1.3.
5.2.4. Регистрация и оформление результатов исследования
Регистрация результатов анализа производится по учетным формам филиалов (отделений) ФБУЗ "ЦГиЭ" согласно п. 5.1.4.
5.2.5. Порядок передачи информации и выделенных культур лабораториями филиалов (отделений) ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в муниципальном образовании в ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации
Информация о выделенных штаммах Y. pseudotuberculosis и Y. enierocolitica в лабораториях филиалов (отделений) ФБУЗ "ЦГиЭ" от людей и объектов окружающей среды передается в ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации.
Культуры Y. pseudotuberculosis и Y. enierocolitica направляются в лаборатории ФБУЗ "ЦГиЭ" в субъекте Российской Федерации. Передача и транспортирование осуществляются в соответствии с действующими санитарными правилами по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности. Прилагается паспорт на культуру в одном экземпляре (прилож. 7 к МУ), сопроводительное письмо, акт передачи живых культур.
5.3. Порядок организации и проведения лабораторных исследований на иерсиниозы в лабораториях ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации
5.3.1. Требования к лабораториям ФБУЗ
"Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации
Согласно п. 5.1.1.
5.3.2. Номенклатура и объем исследований
Микробиологические лаборатории ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации проводят в плановом порядке:
- исследования проб с эпидемиологически значимых объектов "объектов риска" (смывы с оборудования, инвентаря, овощей, пищевых продуктов в овощехранилищах, мясо- и молокоперерабатывающих предприятиях, объектах торговли продуктами растительного происхождения, пищеблоках объектов общественного питания, общеобразовательных учреждениях, детских и медицинских организациях);
- исследования продуктов животноводства, птицеводства, плодоовощной продукции в разрезе Программы производственного контроля (по согласованию);
- исследования материала от больных (подозрительных на заболевание) (по согласованию);
- подтверждение и идентификацию культур иерсиний, выделенных лабораториями МО и филиалами (отделениями) ФБУЗ "ЦГиЭ" по морфологическим, культурально-биохимическим и серологическим свойствам.
По эпидпоказаниям исследованию подлежат:
- материал от людей, находящихся в одинаковых с больными условиях по риску заражения, в эпидемических очагах при проведении санитарно-противоэпидемических мероприятий;
- смывы с овощей, фруктов и других продуктов, не подвергающихся термической обработке;
- смывы с поверхности оборудования, инвентаря и тары в овощехранилищах, пищеблоках организованных коллективов, домашних очагах;
- остатки подозреваемых пищевых продуктов (салаты, сок домашнего приготовления, фляжное молоко, творог домашнего приготовления, сырое свиное мясо, субпродукты и т.д.);
- экскременты домашних и сельскохозяйственных животных, смывы с их подстилок;
- помет мелких млекопитающих;
- вода открытых водоемов и из ёмкостей для хранения;
- исследование проб, собранных в ходе эпизоотологического обследования (тонкий кишечник мелких млекопитающих и птиц, брыжейка и мезентеральные лимфоузлы, гнезда грызунов, почва).
В лабораториях ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации проводят исследования материала в следующем объеме:
1) посев на среды накопления, "холодовое обогащение" с периодическими высевами на дифференциально-диагностические среды, отсев характерных для иерсиний колоний на ПУС с одновременным выполнением экспресс-методов диагностики иерсиниозов (ПЦР, Real-time ПЦР);
2) идентификация и дифференциация выделенных культур до вида по морфологическим, биохимическим и антигенным свойствам, в том числе с использованием полу- или автоматизированных систем идентификации ("Vitek-2". "Mini API". "Микроб-2", "Микроб-Автомат" или аналоги) при наличии оборудования и тест-систем;
3) индикация и идентификация культур иерсиний с использованием ПЦР, Real-time ПЦР;
4) выявление антител в парных сыворотках (РНГА, ИФА, РА).
5.3.3. Порядок лабораторных исследований на иерсиниозы в ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации
5.3.3.1. Правила отбора и транспортирования проб из объектов окружающей среды.
Отбор и транспортирование материала осуществляют согласно п. 5.2.3.1.
5.3.3.2. Правила отбора и транспортирования клинического материала.
Отбор и транспортирование материала осуществляют согласно пп. 5.1.3.1 и 5.2.3.2.
5.3.3.3. Правила отбора проб материала от животных, собранных при обследовании природных или антропоургических очагов иерсиниозов.
Материал, собранный в ходе обследования природных и антропургических очагов, должен быть свежим, поэтому органы животных следует забирать в максимально короткие сроки или соблюдать низкотемпературный режим для транспортировки и хранения полевого материала. Лабораторному исследованию подвергают: тонкий кишечник мелких млекопитающих, птиц, сельскохозяйственных и домашних животных, субстрат гнезд грызунов:
- Тонкий кишечник. 1,0 - 2,0 г в месте перехода тонкой кишки в толстую с содержимым забирают стерильно и помещают в 5,0 мл среды накопления.
- Брыжейка, мезентеральные лимфоузлы. 1,0 - 2,0 г стерильно измельчают, 1 мл суспензии помещают в 5,0 мл среды накопления.
- Гнезда грызунов. Субстраты гнезд (примерно 10 г каждого) растирают в ступке пестиком с фосфатно-буферным раствором, 1,5 мл взвеси вносят в 15,0 мл среды накопления.
5.3.3.4. Порядок проведения лабораторного исследования на иерсиниозы объектов окружающей среды, материала от людей, полевого материала, выделенных культур.
Исследование материала от людей с диагностической целью и по эпидпоказаниям, проб из объектов окружающей среды по эпидпоказаниям проводят в соответствии с п. 5.1.3. При осуществлении планового эпизоотологического мониторинга за природными очагами иерсиниозов высевы со сред накопления рекомендуется проводить до 21 суток.
Идентификация выделенной культуры проводится по следующим тестам:
- характерная морфология колоний;
- типичные биохимические свойства;
- чувствительность к псевдотуберкулезному фагу;
- серологическое типирование с использованием диагностических сывороток к Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica;
- биотипирование Y. enterocolitica по набору тестов (ферментация салицина, липазная активность, образование индола, ферментация ксилозы, нитратредуктазная активность, реакция Фогес-Проскауэра);
- определение вирулентности иерсиний по фенотипическим признакам (тест на аутоагглютинацию, определение кальцийзависимости роста иерсиний);
- РА на стекле с сывороткой к вирулентным иерсиниям.
5.3.4. Регистрация и оформление результатов исследования
Регистрация результатов анализа производится по учетным формам ФБУЗ "ЦГиЭ" согласно п. 5.1.4.
5.3.5. Порядок nepeдачи информации и выделенных культур лабораториями ФБУЗ "Центр гигиены эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации в Региональные центры по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней II - IV групп патогенности
Информация о выделенных или идентифицированных культурах Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica передается в Региональные центры по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней II - IV групп патогенности.
Культуры иерсиний, выделенных от людей, мелких млекопитающих и объектов окружающей среды, и идентифицированные в лабораториях ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации передаются в установленном порядке в Региональные центры по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней II - IV групп патогенности. Передачу и транспортирование осуществляют в соответствии с СП по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов II - IV групп патогенности. Прилагается паспорт на культуру, сопроводительное письмо и акт передачи патогенных биологических агентов III - IV групп за пределы организации.
6. Порядок организации и проведения исследований на иерсиниозы для лабораторий регионального уровня
6.1. Порядок организации и проведения исследований на иерсиниозы в лабораториях Региональных центров по мониторингу возбудителей инфекционных и паразитарных болезней II - IV групп патогенности в федеральных округах
6.1.1. Требования к лабораториям Региональных центров по мониторингу возбудителей инфекционных и паразитарных болезней II - IV групп патогенности
Согласно п. 5.1.1.
6.1.2. Номенклатура и объем исследования
Лаборатории Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней II-IV групп патогенности проводят:
- верификацию культур иерсиний и их расширенную идентификацию;
- диагностические исследования материала от больных и объектов окружающей среды - в случае отсутствия диагностических возможностей на местах, трудности дифференциальной диагностики, наличия тяжелых и атипичных форм инфекции и т.д.;
- исследование проб, собранных в ходе эпизоотологического обследования природных и антропургических очагов иерсиниозов:
- контроль качества питательных сред.
Лаборатории Региональных центров по мониторингу возбудителей инфекционных и паразитарных болезней II - IV групп патогенности проводят исследования в следующем объеме:
- идентификация культур, доставленных (определение биотипа, серотипа возбудителя, определение вирулентности культуры по фенотипическим признакам);
- индикация и идентификация культур иерсиний при использовании ПЦР, Real-time ПЦР;
- посев на среды накопления с одновременным выполнением экспресс-методов диагностики (ПЦР, Real-time ПЦР);
- высев со сред накопления на дифференциально-диагностические среды, отсев подозрительных колоний для последующей родовой и видовой дифференциации:
- идентификация возбудителя с использованием полу- или автоматизированных систем идентификации ("Vitek-2", "Mini API", "Микроб-2", "Микроб-Автомат" или аналоги) при наличии оборудования.
6.1.3. Организация и обеспечение исследований на иерсиниозы в лабораториях Региональных центров по мониторингу возбудителей инфекционных и паразитарных болезней II-IV групп патогенности
Порядок исследований клинического материала, проб из объектов окружающей среды, грызунов, птиц, материала от сельскохозяйственных и домашних животных проводят в соответствии с п. 5.1.3.
К подтверждающим тестам относительно Y. pseudotuberculosis/ Y. enterocolitica относятся:
- характерная морфология колоний;
- типичные биохимические свойства;
- чувствительность к псевдотуберкулезному бактериофагу:
- серологическое типирование с использованием диагностических сывороток к Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis;
- биотипирование Y. enterocolitica по набору тестов (ферментация салицина, ксилозы, образование индола, редукция нитратов, реакция Фогес-Проскауэра);
- тест на аутоагглютинацию, определение кальцийзависимости роста иерсиний, определение температурозависимой морфологии колоний; РА на стекле для выявления вирулентных иерсиний с СВИ;
- определение чувствительности к антибиотикам диско-диффузионным методом;
- определение видоспецифических ДНК-мишений методом ПЦР.
6.1.4. Регистрация и оформление результатов исследования
Регистрация результатов исследования оформляется согласно п. 5.1.4.
6.1.5. Порядок передачи информации и выделенных культур лабораториями Региональных центров по мониторингу возбудителей инфекционных и паразитарных болезней II - IV групп патогенности в Референс-центры
Информация о выделенных и идентифицированных культурах Y. pseudotuberculosis и патогенных Y. enterocolitica передается в Референс-центр по мониторингу за возбудителями иерсиниозов (ФБУН "Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера" Роспотребнадзора) и Референс-центр по мониторингу за возбудителями природно-очаговых инфекций (ФКУЗ "Иркутский НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока" Роспотребнадзора).
При невозможности проведения диагностических исследований для установления причинно-следственной связи при работе в эпидемическом очаге, верификации и расширенной идентификации культур в Региональном центре по мониторингу за возбудителями II - IV групп патогенности лабораторные исследования (пп. 6.1.2 и 6.1.3) проводятся в других Региональных центрах по мониторингу за возбудителями II - IV групп патогенности по согласованию с Референс-центром по иерсиниозам (Региональные опорные базы-консультантов). Лаборатории данных центров должны соответствовать требованиям, изложенным в п. 5.1.1.
Культуры Y. pseudotuberculosis и патогенных Y. enterocolitica от людей, грызунов и объектов окружающей среды, идентифицированные в лабораториях ФБУЗ "ЦГиЭ" в субъекте РФ, Региональных центрах по мониторингу возбудителей II - IV групп патогенности и в Региональных опорных базах - консультантов в федеральных округах передаются в установленном порядке в Референс-центр по иерсиниозам, а для территорий Сибирского и Дальневосточного федеральных округов - в Референс-центр по природно-очаговым инфекционным болезням.
Передачу и транспортирование осуществляют в соответствии с действующими СП по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов II - IV групп патогенности. Прилагается паспорт на культуру (прилож. 7 к МУ), сопроводительное письмо и акт передачи патогенных биологических агентов III - IV групп за пределы организации.
7. Порядок организации и проведения исследований на иерсиниозы в лабораториях федерального уровня (Референс-центр по мониторингу за иерсиниозами, Референс-центр по мониторингу за возбудителями природно-очаговых инфекционных болезней)
7.1. Требования к лабораториям Референс-центра по мониторингу за иерсиниозами и Референс-центра по мониторингу и возбудителями природно-очаговых инфекционных болезней
Согласно п. 5.1.1.
7.2. Номенклатура и объем исследований
Диагностические лаборатории Референс-центров проводят:
- расширенную идентификацию и изучение биологических, биохимических, молекулярно-генетических характеристик иерсиний, в том числе культур с атипичными свойствами;
- проводят генотипирование иерсиний современными методами:
- проводят исследования клинического материала, проб из объектов окружающей среды и проб полевого материала - на договорной основе;
- оказывают консультативно-методическую помощь по проведению лабораторных исследований на иерсиниозы организациям Роспотребнадзора и здравоохранения в субъектах Российской Федерации;
- обеспечивают повышение профессиональной подготовки специалистов лабораторного звена организаций Роспотребнадзора и здравоохранения при наличии соответствующих разрешительных документов;
- направляют в Государственные коллекции штаммы иерсиний в установленном порядке;
- организуют работы по внешнему контролю качества лабораторных исследований и мониторинга за иерсиниями по согласованию с Федеральной службой по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека.
7.3. Организация и обеспечение деятельности при мониторинге за иерсиниозами
Материалом для исследования служат культуры иерсиний, в том числе культуры с атипичными свойствами, выделенные в лабораториях территориального (муниципального) и регионального уровней; клинический материал, сыворотка крови больных иерсиниозами и подозрительных на инфекцию лиц, пробы из объектов окружающей среды и полевой материал по эпидпоказаниям и на договорной основе.
При исследовании культур возбудителей иерсиниозов, в том числе культур с атипичными свойствами, используют биологические и современные высокотехнологичные методы бактериологического, иммуносерологического и молекулярно-генетического анализа, а также современные серологические методы исследования сывороток крови больных иерсиниозами и подозрительных на эти инфекции, обследуемых по эпидпоказаниям.
Порядок исследования клинического материала, проб из объектов окружающей среды, мелких млекопитающих на иерсиниозы соответствуют п. 5.1.3.
Идентификация поступивших культур осуществляется по полной схеме:
- характерная морфология колоний;
- изучение биохимических свойств на расширенной биохимической панели, определение биотипа Y. enterocolitica;
- постановка развернутой реакции агглютинации с иерсиниозными агглютинирующими сыворотками (к Y. enterocolitica серотипов 0:3; 0:5,27; 0:8; 0:9 и др.; к Y. pseudotuberculosis серотипов 0:1, 0:3);
- определение детерминант патогенности в ПЦР (гены "острова высокой патогенности" НР1; "острова патогенности" YAPI; гены адгезии - инвазии inv, ail, гены энтеротоксинов ystA, ystB, гены плазмиды вирулентности иерсиний);
- определение чувствительности к антибиотикам (диско-диффузионным методом, методом разведений в агаре и бульоне);
- определение плазмидного спектра выделенных штаммов;
- определение серо-генотипа ПЦР (в случае отсутствия диагностических сывороток);
- электрофорез в пульсирующем поле (PFGE) - определение пульсотипа;
- мультилокусный вариабельный анализ (MLVA);
- определение вирулентности У. pseudotuberculosis (определение при пероральном заражении белых мышей с помощью зонда; постановка кератоконъюнктивальной пробы на морских свинках).
При идентификации культур иерсиний с атипичными свойствами используют дополнительные биохимические, серологические, иммунологические и другие методы для подтверждения принадлежности культур к роду Yersinia и известным видам:
- расширенная панель биохимических тестов;
- ПЦР с использованием дополнительных специфических праймеров:
- постановка иммуносерологических реакций с использованием моноклональных антител.
Окончанием идентификации должно быть составление молекулярного профиля возбудителя.
7.4. Порядок взаимодействия лабораторий Референс-центра по мониторингу за иерсиниозами с организациями Роспотребнадзора
Информация об идентифицированных культурах иерсиний направляется в Региональные центры по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней II - IV групп патогенности по согласованию с Референс-центром по иерсиниозам. Оригинальные штаммы иерсиний, идентифицированные в бактериологических лабораториях Референс-центров, передаются в Государственную коллекцию штаммов микроорганизмов Национального центра верификации диагностической деятельности ФКУЗ "РосНИПЧИ "Микроб" Роспотребнадзора.
Передачу и транспортирование осуществляют в соответствии с СП по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности. Прилагается паспорт на культуру в одном экземпляре, сопроводительное письмо, акт передачи патогенных биологических агентов III - IV групп за пределы организации.
______________________________
*(1) Высеваемость иерсиний наиболее высока в первые 3 - 5 дней болезни и до назначения антибиотиков, результаты бактериологического исследовании улучшаются, если взятие материала производится 3-кратно в течение первой недели болезни (госпитализации).
*(2) Производственный выпуск "Тест-системы иммуноферментной для выявления антигенов иерсиний псевдотуберкулеза 1 серотипа" будет осуществляться в НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера с 2012 г.
*(3) Прописи сред и способ приготовления представлены в прилож. 8.
*(4) При использовании сред Ресселя l и ll проводят постановку следующих биохимических гестов - сахароза, рамиоза, раффиноза, салицин, ксилоза, сорбит, индол.
Руководитель Федеральной службы |
Г.Г. Онищенко |
Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.
Приведены Методические указания МУК 4.2.3019-12 "Организация и проведение лабораторных исследований на иерсиниозы на территориальном, региональном и федеральном уровнях".
Методические указания определяют организацию и порядок проведения исследований на иерсиниозы в лабораториях территориального, регионального и федерального уровней.
Они предназначены для специалистов органов и организаций Роспотребнадзора, а также могут быть использованы медицинскими и другими организациями, независимо от организационно-правовой формы и формы собственности.
Методические указания МУК 4.2.3019-12 "Организация и проведение лабораторных исследований на иерсиниозы на территориальном, региональном и федеральном уровнях" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 18 июня 2012 г.)
Текст методических указаний приведен по официальному изданию Роспотребнадзора, 2012
Организация и проведение лабораторных исследований на иерсиниозы на территориальном, региональном и федеральном уровнях: Методические указания. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2012. - 59 с.
1. Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Е.Б. Ежлова. Ю.В. Демина. Н.В. Шеенков): Федеральным бюджетным учреждением науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера" Роспотребнадзора (Г.Я. Ценева, Е.А. Воскресенская. Г.И. Кокорина, Е.А. Богумильчик): Федеральным казенным учреждением здравоохранения "Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока" Роспотребнадзора (М.В. Чеснокова. С.В. Балахонов. В.Т. Климов. К.Л. Тирских. М.Б. Черепанова); Федеральным бюджетным учреждением здравоохранения "Центр гигиены и эпидемиологии в Новосибирской области" (Т.В. Каримова. О.В. Якунина)
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 18 июня 2012 г.
3. Введены в действие с момента утверждения
4. Введены впервые