Методические указания МУК 4.1.2865-11 "Определение остаточных количеств Фенпропидина в зеленой массе, зерне и соломе зерновых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ 31 марта 2011 г.)

Методические указания МУК 4.1.2865-11
"Определение остаточных количеств Фенпропидина в зеленой массе, зерне и соломе зерновых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ 31 марта 2011 г.)

Дата введения: с момента утверждения

Общие положения и область применения

Свидетельство об аттестации методики от 25.06.2010 N 01.5.04.686.

Настоящий документ устанавливает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации Фенпропидина в зеленой массе и зерне зерновых культур в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг и в соломе в диапазоне 0,04 - 0,4 мг/кг.

Действующее вещество: Фенпропидин.

Структурная формула:

Название действующего вещества по ИЮПАК: (RS)-1-[3-(4-трет-бутилфенил)-2-метилпропил]пиперидин.

Молекулярная масса: 273,5.

Эмпирическая формула: .

Химически чистое вещество представляет собой бледно-желтую слегка вязкую жидкость без запаха.

Температура кипения > 250°С, 70,2°С/1.1 Ра.

Давление пара 17 мРа (25°С).

Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода: (рН 7,25°С).

Растворимость в воде (, 25°С): 530 (рН 7); 6,2 (рН 9).

Легко смешивается с ацетоном, этанолом, толуолом, н-октанолом и гексаном (25°С). Стабилен при хранении в закрытом контейнере при комнатной температуре, по крайней мере, в течение 3 месяцев. Водные растворы устойчивы к воздействию УФ-света и гидролизу при 80°С (рН 4, 7 и 10). 10,1 (сильное основание).

Краткая токсикологическая характеристика: у крыс острая оральная токсичность ; при подкожном введении . Ингаляционная токсичность 1 220 мг в воздуха (Время экспозиции 4 ч). У кроликов вызывает раздражение кожи и глаз.

Не обладает мутагенным, канцерогенным и тератогенным действием.

Область применения: Фенпропидин - лиственный фунгицид системного действия с целебным защитным и искореняющим эффектом. Подавляет развитие таких заболеваний зерновых культур, как ложномучнистая роса, ржавчина и пятна на листьях, вызываемые, соответственно, фибами из родов Erysiphegraminis, Puccinia SPP и Rhynchosporium secalis.

Гигиенические нормативы в России для фенпропидина: МДУ в зерне хлебных злаков 0,25 мг/кг.

1. Метрологическая характеристика метода

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Объект анализа	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), , %	Показатель внутрилабораторной прецизионности, , %	Показатель воспроизводимости, , %	Показатель точности* (границы относительной погрешности), , %
Зеленая масса	0,01 - 0,10	6	7	8	16
Зерно	0,01 - 0,10	6	7	8	16
Солома	0,04 - 0,10	5	6	8	16
	0,10 - 0,40	3	4	5	10
* Соответствует расширенной неопределенности (в относительных единицах) при коэффициенте охвата k=2.

Таблица 2

Полнота извлечения Фенпропидина, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для n=20, Р=0.95

Анализируемый объект	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Среднее значение определения, %	Стандартное отклонение, S	Доверительный интервал среднего результата,
Зеленая масса	0,01	0,01 - 0,1	87,3	5,15	2,4
Зерно	0,01	0,01 - 0,1	90,4	5,8	2,7
Солома	0,04	0,04 - 0,4	88,15	8,3	3,9

2. Метод измерения

Методика основана на определении Фенпропидина методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его экстракции из образцов смесью органического растворителя с водой и очистки экстракта путем перераспределения кислотно-основных форм Фенпропидина между двумя несмешивающимися фазами и методом твердо-фазной экстракции.

Идентификация Фенпропидина проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Жидкостный хроматограф "ACQUITY" фирмы "Waters" с быстросканирующим УФ-детектором, снабженным дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки
Весы аналитические ВЛА-200	ГОСТ 24104-2001
Весы технические ВЛКТ-500 рН-метр фирмы "Hanna Instrument", мод. Р212	ГОСТ 24104-2001
Колбы мерные на 10, 50, 100,	ГОСТ 23932-90
Микродозаторы Ленпипет переменного объема от 200 до и от 1 до
Пипетки градуированные	ГОСТ 29227-91
Цилиндры мерные на 50 и	ГОСТ 23932-90

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Ацетон, чда	ГОСТ 2603-79
Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ" или хч	ТУ 6-09-3534-87
Гексан, хч	ТУ 2631-003-05807999-98
Вода бидистиллированная, деионизированная,	ГОСТ 6709-79
Фенпропидин с содержанием основного вещества 97,7%, Мактешим Аган
Натрий сернокислый, безводный, хч	ГОСТ 4166-76
Соляная кислота, 0,1М водный раствор
Гидроксид натрия, 1М водный раствор
Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 40:60

Допускается использование реактивов квалификацией не ниже указанных.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Аналитическая колонка ACQUITY UPLC ВЕН С18 (100 х 2.1) мм, 1,7 мкм (Waters)
Ультразвуковая баня "Сапфир"
Воронки лабораторные В-75-110	ГОСТ 25336-82
Бидистиллятор
Ротационный вакуумный испаритель фирмы BUCHI, мод. R205
Фильтры бумажные "красная лента",	ТУ 6.091678-86
Патроны, заполненные силикагелем 60 (Merck), 0,5 г

Допускается использование другого вспомогательного оборудования с техническими характеристиками не хуже указанных.

4. Требования безопасности

4.1. При работе необходимо соблюдать требования техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007). Организация обучения работников безопасности труда - ГОСТ 12.0.004.

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны".

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха и относительной влажности не более 80%.

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку (Acquity ВЕН С18) кондиционируют в потоке подвижной фазы до стабилизации нулевой линии.

7.2. Приготовление растворов

7.2.1. 0.005 М раствор ортофосфорной кислоты: 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом , растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.2.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 40:60 по объему, используя мерные цилиндры.

7.2.3. Приготовление элюента для твердофазной экстракции. В мерную колбу вместимостью помещают ацетона и доводят объем до метки гексаном. Перемешивают. Элюент хранят в вытяжном шкафу и используют свежеприготовленным.

7.3. Приготовление основного и градуировочных растворов

7.3.1. Основной раствор с концентрацией ; точную навеску Фенпропидина помещают в мерную колбу вместимостью , растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки тем же растворителем.

Градуировочные растворы с концентрациями 0,1, 0,2, 0,5, 0,75 и готовят методом последовательного разбавления основного раствора по объему, используя подвижную фазу.

7.3.2. Раствор N 1 с концентрацией : в мерную колбу вместимостью вносят основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.3. Раствор N 2 с концентрацией : в мерную колбу вместимостью вносят раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.4. Раствор N 3 с концентрацией : в мерную колбу вместимостью помещают раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.5 Раствор N 4 с концентрацией : в мерную колбу вместимостью помещают раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.6. Раствор N 5 с концентрацией : в мерную колбу вместимостью помещают раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4°С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты определения Фенпропидина в зеленой массе, зерне и соломе пшеницы используют ацетонитрильные растворы вещества.

7.4. Построение градуировочного графика

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация Фенпропидина в растворе) в хроматограф вводят по градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации Фенпропидина в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:

С=KS, где

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0.99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

, где

С - аттестованное значение массовой концентрации Фенпропидина в градуировочном растворе;

- результат контрольного измерения массовой концентрации Фенпропидина в градуировочном растворе;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при Р=0,95).

7.5. Подготовка патронов для твердофазной экстракции

Непосредственно перед употреблением через патрон, заполненный силикагелем, пропускают гексана.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб зерна производится в соответствии с ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950-79) "Зерновые. Отбор проб зерна". Пробы зерна и соломы для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Перед анализом зерно и солому измельчают на лабораторных мельницах.

9. Проведение определения

9.1. Определение Фенпропидина в зеленой массе, зерне и соломе пшеницы

20 г зерна или измельченной зеленой массы или 5 г соломы помещают в коническую колбу вместимостью и экстрагируют смеси ацетона и воды в соотношении 7:3 в ультразвуковой бане в течение 15 мин. Массу фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют с тем же объемом экстрагента. Объединенный экстракт упаривают на вакуумном ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40°С до полного удаления ацетона. Объем водного остатка доводят до , подкисляют 1 М раствором хлористоводородной кислоты до рН 3,0 и промывают дважды по гексана. Гексановый экстракт отбрасывают. К отделенному водному слою прибавляют около 1 М раствора гидроксида натрия до рН 9,0 и экстрагируют фенпропидин трижды по гексана. Экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40°С. Сухой остаток растворяют в гексана и вносят в откондиционированный патрон, заполненный силикагелем. Патрон промывают гексана. Промывку отбрасывают. Фенпропидин элюируют элюента, приготовленного по п. 7.2.3. Элюат упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в подвижной фазы. полученного раствора вводят в хроматограф.

9.2. Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостной хроматограф "ACQUITY" фирмы "Waters" с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка ACQUITY UPLC ВЕН С18 (2,1x100) мм, 1,7 мкм (Waters). Температура колонки . Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 40:60. Скорость потока элюента: . Рабочая длина волны УФ-детектора 220 нм. Объем вводимой пробы .

Время удерживания Фенпропидина .

Линейный диапазон детектирования сохраняется в интервале концентраций .

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание Фенпропидина в зеленой массе, зерне и соломе пшеницы (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

, где

- площадь пика Фенпропидина на хроматограмме испытуемого образца, (AU);

К - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, ;

Р - навеска анализируемого образца, г;

f - полнота извлечения Фенпропидина, приведенная в табл. 2 (%).

Содержание остаточных количеств фенпропидина в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор Фенпропидина с концентрацией , разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

, где

и - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости ().

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

мг/кг при вероятности Р=0,95, где

Х - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг.

, где

S - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее нижней границы определения" (например: менее 0,01 мг/кг*, где *- 0,01 мг/кг - предел обнаружения Фенпропидина в зеленой массе и зерне пшеницы).

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

, где

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

, где

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

, где

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

, где

- среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

(1)

Проводят сопоставление результата контроля процедуры ( с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

, (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

, где

и - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

14. Разработчики

Долженко В.И., Цибульская И.А., Журкович И.К., Луговкина Н.В., Ковров Н.Г. (ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, г. Санкт-Петербург).

Методика прошла метрологическую экспертизу (Свидетельство об аттестации N 01.5.04.2.015.25.11.09 от 26.11.09).

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко