Методические указания МУК 4.1.2773-10 "Определение массовых концентраций летучих жирных кислот (уксусная, пропионовая, изо-масляная, масляная, валериановая, изо-капроновая, капроновая) в биосредах (кровь) газохроматографическим методом" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 22 ноября 2010 г.)

Методические указания МУК 4.1.2773-10
"Определение массовых концентраций летучих жирных кислот (уксусная, пропионовая, изо-масляная, масляная, валериановая, изо-капроновая, капроновая) в биосредах (кровь) газохроматографическим методом"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 22 ноября 2010 г.)

Дата введения: с момента утверждения
Введены впервые

1. Общие положения и область применения

1.1. Методические указания по определению массовых концентраций летучих жирных кислот (уксусная, пропионовая, изо-масляная, масляная, валериановая, изо-капроновая, капроновая) в биосредах (кровь) предназначены для использования территориальными органами и подведомственными организациями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, лечебными и научными учреждениями, осуществляющие деятельность в области профпатологии и экологии человека, научно-исследовательскими институтами, занимающимися вопросами гигиены окружающей среды.

1.2. Методические указания разработаны с целью обеспечения контроля за содержанием летучих жирных кислот в биологических средах у населения, проживающего в районах с повышенным уровнем загрязнения окружающей среды.

Методические указания метрологически аттестованы (свидетельство N 223.1.11.11.98/2009.)

1.3. Уксусная кислота (), мол. масса 60,05.

Уксусная кислота - бесцветная жидкость с характерным запахом.

. Растворяется в воде и органических растворителях.

Плотность уксусной кислоты (15°С) 1,0553 . Обладает сильным раздражающим действием. Вызывает гипертрофические и атрофические фарингиты, ларингиты, а также конъюнктивиты и бронхиты [пункт 1 приложения настоящих МУК]*.

1.4. Пропионовая кислота (), мол. масса 74,08.

Пропионовая кислота - бесцветная жидкость с характерным запахом. . Смешивается в любых соотношениях с водой. Растворяется в органических растворителях. Плотность пропионовой кислоты (20°С) 0,993 . Вызывает изменения функционального состояния центральной и вегетативной нервной систем, а также функций печени, изменения интенсивности тканевого дыхания [1].

1.5. Изо-масляная кислота (), мол. масса 88,00.

Изо-масляная кислота - бесцветная жидкость с характерным запахом. . Растворяется в органических растворителях. Плотность изо-масляной кислоты (20°С) 0,958 . Раздражает кожу и слизистые оболочки [1].

1.6. Масляная кислота (), мол. масса 80,10.

Масляная кислота - бесцветная жидкость с характерным запахом.

. Растворяется в органических растворителях. Плотность масляной кислоты (20°С) 0,958 . Раздражает кожу и слизистые оболочки [1].

1.7. Валериановая кислота (), мол. масса 102,14.

Валериановая кислота - бесцветная прозрачная жидкость с характерным запахом. . Плотность валериановой кислоты (25°С) 0,9391 . Вызывает изменения функций печени [1].

1.8. Капроновая кислота (), мол. масса 116,16.

Капроновая кислота - бесцветная прозрачная жидкость с резким неприятным запахом. . Плотность капроновой кислоты (25°С) 0,929 . Вызывает патологические сдвиги в центральной и периферической нервных системах, печени и миокарде [1].

1.9. Диапазон измерений массовых концентраций летучих жирных кислот приведен в табл. 1.

Таблица 1

Наименование определяемых веществ и диапазоны измерений

Наименование определяемого вещества	Диапазон измерений,
1. Уксусная кислота	от 1,56 до 16 включ.
2. Пропионовая кислота	" 1 " 10 "
3. Изо-масляная кислота	" 1 " 10 "
4. Масляная кислота	" 1 " 10 "
5. Валериановая кислота	" 0,5 " 5 "
6. Капроновая кислота	" 0,5 " 5 "

2. Приписанные характеристики погрешности измерений

Методика обеспечивает получение результатов измерений с погрешностью, не превышающей значений, приведенных в табл. 2.

Таблица 2

Диапазон измерений, значения показателей точности, повторяемости, внутрилабораторной прецизионности, воспроизводимости

Диапазон измерений,	Показатель повторяемости (относительное значение среднеквадратического отклонения повторяемости), , %	Показатель внутрилабораторной прецизионности (относительное значение среднеквадратического отклонения внутрилабораторной прецизионности), , %	Показатель воспроизводимости (относительное значение среднеквадратического отклонения воспроизводимости), , %	Показатель точности* (границы относительной погрешности при вероятности Р = 0,95), , %
от 0,5 до 1 включ.	9	10	11	22
св. 1 " 16 "	6	7	8	16
* Соответствует относительной расширенной неопределенности измерений при коэффициенте охвата 2.

3. Сущность метода

Методика основана на экстракции летучих жирных кислот из крови изо-бутиловым спиртом в кислой среде и последующем газохроматографическим анализом экстракта.

Выполнение измерений массовой концентрации летучих жирных кислот выполняют методом газовой хроматографии с использованием пламенно-ионизационного детектора.

Длительность анализа, включая экстракцию пробы - 60 мин.

4. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы

При подготовке проб крови и измерении концентраций летучих жирных кислот в анализируемом растворе применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.

4.1. Средства измерений

Хроматограф газовый "Кристалл 2000М" с пламенно-ионизационным детектором
Секундомер "Агат"	ТУ 25-1894.003-90
Микрошприцы МШ-10	ТУ 2.833.106-2000
Весы аналитические ВЛР-200	ГОСТ 24104-2001
Разновесы	ГОСТ 7328-82

См. ГОСТ OIML R 111-1-2009 "Государственная система обеспечения единства измерений. Гири классов , , , , , , , и . Часть 1. Метрологические и технические требования", введеный в действие приказом Росстандарта от 22 августа 2011 г. N 233-ст

Колбы мерные вместимостью 100, 1 000	ГОСТ 1770-74
Пипетки вместимостью 5, 10	ГОСТ 29227-91
Бюксы стеклянные	ГОСТ 25336-82
Пробирки конические вместимостью 10	ГОСТ 1770-74
Дозаторы	ГОСТ 28311-89
Уксусная кислота	ГСО 8462-2003

4.2. Вспомогательные устройства

Хроматографическая капиллярная колонка HP-FFAP - 50 м х 0,32 мм х 0,5 мкм
Редуктор кислородный	ТУ 26-05-236-73
Миницентрифуга СМ-4, 6 000 об./мин

4.3. Материалы

Газообразный азот в баллоне	ТУ 6-027376-65
Водород технический	ГОСТ 3022-80
Воздух в баллоне	ГОСТ 17433-80
Бумага индикаторная универсальная рН 1,0-10,0 в упаковке 100 штук ПНД 50-975-84 (перечень нормативных документов) (Чешская Республика)

4.4. Реактивы

Пропионовая кислота для газовой хроматографии с содержанием основного вещества 99,9% (Sigma-Aldrich Buchs Switzerland)
Изо-масляная кислота для газовой хроматографии с содержанием основного вещества 99,9% (Sigma-Aldrich USA)
Масляная кислота для газовой хроматографии с содержанием основного вещества 99,9% (Sigma-Aldrich USA)
Валериановая кислота для газовой хроматографии с содержанием основного вещества 99,9% (Sigma-Aldrich Buchs Switzerland)
Изо-капроновая кислота для газовой хроматографии с содержанием основного вещества 99,9% (Sigma-Aldrich Buchs Switzerland))
Капроновая кислота для газовой хроматографии с содержанием основного вещества 99,9% (Sigma-Aldrich Buchs Switzerland)
Вода дистиллированная	ГОСТ 6709-72
Изо-бутиловый спирт, чда	ГОСТ 6016-77
Серная кислота, осч	ГОСТ 14262-78
Калий двухромовокислый, чда	ГОСТ 4220-75
Натрий гидроксид, хч	ГОСТ 4328-77

Допускается применение других типов средств измерений, вспомогательного оборудования и химреактивов с аналогичными или лучшими метрологическими и техническими характеристиками.

5. Требования безопасности

5.1. При выполнении работ соблюдаются меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004-91 [2], имеются средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83 [3] и соблюдаются правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79* 2001 [4].

5.2. При работе необходимо соблюдать "Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях" (Утверждены МЗ СССР 20.12.82), М., 1981 и "Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением" (Утверждены Госгортехнадзором СССР 27.11.87), М.: Недра, 1989.

5.3. При работе с реактивами следует соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76 [5] и 12.1.005-88 [6]. Помещение должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией.

5.4. При работе с биологическими средами необходимо соблюдать правила в соответствии с требованиями СП 1.3.2322-08 [7].

5.5. При выполнении измерений с использованием газового хроматографа следует соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79* 2001 [4] и инструкции по эксплуатации прибора.

6. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика и опыт работы на газовом хроматографе и в химической лаборатории, прошедшие соответствующий инструктаж, освоившие метод в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы оперативного контроля при выполнении процедур контроля погрешности.

7. Условия измерений

7.1. При приготовлении растворов и подготовке проб к анализу соблюдают следующие условия:

- температура воздуха ;

- атмосферное давление 630-800 мм. рт. ст.;

- влажность воздуха не более 80% при температуре 25°С.

7.2. Выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией к прибору.

8. Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, приготовление стандартных смесей, установление градуировочной характеристики.

8.1. Подготовка посуды

Посуду для анализа замочить на 1 час в свежеприготовленном 3%-ном растворе двухромовокислого калия в серной кислоте (5,70 г двухромовокислого калия на 100 концентрированной серной кислоты), отмыть в проточной водопроводной воде, ополоснуть дистиллированной водой и просушить при температуре 120°С.

8.2. Подготовка хроматографической колонки

Хроматографическая капиллярная колонка протестирована на заводе-изготовителе: образец MN-Test температурный режим: колонка - от 80°С до 320°С при скорости нагрева колонки 8°С/мин, детектор ионизации в пламени - 280°С.

Колонку подключают к детектору, записывают нулевую линию в рабочем режиме. При отсутствии шумовых сигналов колонка готова к работе.

8.3. Приготовление стандартных растворов

Для построения градуировочного графика готовят серию стандартных растворов. Для этого применяют стандартные образцы.

8.3.1. Исходный стандартный раствор летучих жирных кислот. В мерную пробирку вместимостью 10 , вносят 3 изо-бутилового спирта, добавляют 15 уксусной кислоты, по 10 пропионовой, изо-масляной, масляной кислот и по 5 валериановой, изо-капроновой и капроновой кислот. Раствор доводят до 5 изо-бутиловым спиртом, перемешивают. Концентрация компонентов в исходной стандартной смеси (с учетом плотности и содержания основного вещества) составляет для уксусной кислоты - 3 120 , пропионовой - 1 996 , изо-масляной кислоты - 1 916 , масляной кислоты - 1 918 , валериановой кислоты - 930 , изо-капроновой кислоты - 923 , капроновой кислоты - 923 . Срок хранения раствора 12 ч при комнатной температуре.

8.3.2. 1% раствор серной кислоты. В мерную колбу вместимостью 100 вносят 20 дистиллированной воды, добавляют 1 серной кислоты. Объем раствора в колбе доводят до метки после охлаждения дистиллированной водой, перемешивают.

8.3.3. 0,4% раствор натрия гидроксида. В мерную колбу объемом 100 вносят 0,4 г натрия гидроксида и доводят до метки после охлаждения дистиллированной водой, перемешивают.

8.4. Установление градуировочной характеристики

8.4.1. Приготовление градуировочных растворов для калибровки. Градуировочную характеристику устанавливают методом абсолютной калибровки. По 5 стандартным смесям строят зависимость площади пика на хроматограмме () от концентрации кислоты (). Растворы готовят в мерных пробирках вместимостью 10 из исходного стандартного раствора, в соответствии с табл. 3 объем раствора в каждой пробирке доводят до 2 изобутиловым спиртом.

Таблица 3

Растворы для установления градуировочной характеристики при определении в крови летучих жирных кислот в диапазоне концентраций 0,5-1 и 1-16

Градуировочный раствор	1	2	3	4	5
Объем исходного стандартного раствора,	1	3	5	7	10
Концентрация уксусной кислоты,	1,560	4,680	7,800	10,920	15,600
Концентрация пропионовой кислоты,	0,998	2,990	4,990	6,990	9,980
Концентрация изо-масляной кислоты,	0,960	2,870	4,790	6,710	9,580
Концентрация масляной кислоты,	0,960	2,880	4,790	6,710	9,590
Концентрация валериановой кислоты,	0,470	1,390	2,330	3,260	4,650
Концентрация изо-капроновой кислоты,	0,460	1,390	2,310	3,230	4,620
Концентрация капроновой кислоты,	0,460	1,390	2,310	3,230	4,620

8.4.2. Приготовление рабочих растворов. Для построения градуировочного графика используют цельную кровь, не содержащую исследуемые компоненты. В пробирки со стандартными смесями, приготовленными по п. 8.4.1, добавляют по 2 крови, подкисляют 0,5 1%-го раствора серной кислоты до рН 2-3 (рН среды контролируется по индикаторной бумаге), экстрагируют 2 изо-бутилового спирта в течение 5-10 мин. Для отделения денатурированных белков экстракты центрифугируют при 6000 об/мин в течение 10 мин, надосадочную жидкость переносят в бюкс. Прибавляют по 0,1 0,4%-го раствора щелочи (рН среды контролируется по индикаторной бумаге), растворы упаривают досуха при температуре 50-55°С (экстракты упариваются под ИК-лампой). Добавляют 0,05 1%-го раствора серной кислоты, 0,1 изо-бутанола, перемешивают.

8.4.3. Хроматографирование растворов. В хроматографическую колонку через испаритель вводят по 1 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях: температура термостата колонок 70-160-180-280°С при скорости нагревания 10-5-25°С/мин; расход газа-носителя (азот) - 30 ; деление потока 1:10.

Время удерживания:

- уксусной кислоты - 21 мин с;

- пропионовой кислоты - 23 мин с;

- изо-масляной кислоты - 24 мин с;

- масляной кислоты - 25 мин с;

- валериановой кислоты - 29 мин с;

- изо-капроновой кислоты - 32 мин с;

- капроновой кислоты - 34 мин с.

Градуировочный коэффициент рассчитывают по формуле:

, где

- концентрация вещества в градуировочной смеси, ;

- среднее значение пяти измерений площади пика i-ой концентрации, расхождение между минимальным и максимальным значением которое не должно превышать 4% сигнала милливольт (Мв).

n - количество градуировочных смесей (n = 5).

8.4.4. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят 1 раз в квартал в анализируемой серии измерений. Образцами для контроля стабильности являются градуировочные растворы, выбранные таким образом, чтобы массовая концентрация летучих жирных кислот соответствовала нижней, верхней границам и середине диапазона построения градуировочной характеристики. Градуировка признается стабильной при выполнении условия:

, где

С - заданная концентрация кислоты в градуировочном растворе;

Х - результат измерения массовой концентрации кислоты в градуировочном растворе.

При невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики эксперимент повторяют с другим градуировочным раствором. При повторном невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики.

8.5. Отбор проб

Отбор проб венозной крови объемом не менее 4 производят в тщательно вымытую стеклянную пробирку с притертой пробкой. Анализ крови проводят в течение суток. Возможно хранение пробы крови в морозильной камере не более пяти дней.

9. Выполнение измерений

Отбирают 2 крови и помещают в химически чистую центрифужную пробирку вместимостью 10 , добавляют 0,5 1%-го раствора серной кислоты до достижения рН 2-3 и экстрагируют 2 изобутанола в течение 10 мин. Экстракт центрифугируют при 6000 об/мин в течение 10 мин, надосадочную жидкость переносят в бюкс, прибавляют 0,1 0,4%-го раствора щелочи. Раствор упаривают досуха, добавляют 0,05 1%-го раствора серной кислоты, 0,1 изо-бутанола и проводят количественное определение кислот в подготовленной пробе газохроматографическим методом. Для каждого образца делают по три ввода подготовленной пробы.

Условия выполнения измерений по п. 8.4.3.

10. Обработка (вычисление) результатов измерений

10.1. Концентрацию анализируемых кислот в крови С, рассчитывают по формуле:

, где (1)

- объем рабочего раствора, ;

- объем вводимой пробы, ;

А - количество компонента в объеме вводимой пробы, найденное по калибровочному графику, мкг;

В - объем крови, ;

К - коэффициент пересчета, учитывающий степень экстракции кислот из крови. Коэффициент устанавливается в результате расчета отношения площадей хроматографических пиков, полученных при анализе стандартного образца до и после экстракции:

; ; ;

; ; ;

.

За результат измерения принимают среднее арифметическое значение двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости , (параллельных определений), для которых выполняется условие:

, где (2)

r - предел повторяемости. Значения предела повторяемости приведены в табл. 4.

При невыполнении условия (2) получают дополнительно еще два результата измерений. За результат измерений принимают среднее арифметическое четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие:

, где (3)

- критический диапазон. Значения предела повторяемости приведены в табл. 4.

ГАРАНТ:

Здесь и далее по тексту нумерация приводится в соответствии с источником

10.3. Расхождение между результатами измерений, полученными в двух лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости:

, где (4)

и - результаты измерений массовых концентраций летучих жирных кислот, полученные в разных лабораториях - средние арифметические двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие (4).

В случае, если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "содержание уксусной кислоты в пробе менее 3,0 , где 3,0 - предел обнаружения".

При выполнении условия (4) приемлемы оба результата измерений, и в качестве окончательного может быть использовано их среднее арифметическое значение. Значения предела воспроизводимости приведены в табл. 4.

Таблица 4

Значения пределов повторяемости, воспроизводимости и критического диапазона при доверительной вероятности Р = 0,95

Диапазон измерений,	Предел повторяемости (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в одной лаборатории в условиях повторяемости), r, %	Предел внутрилабораторной прецизионности (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в одной лаборатории в условиях внутрилабораторной прецизионности), , %	Предел воспроизводимости (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в разных лабораториях), R, %
от 0,5 до 1 включ.	25	28	31
св. 1 " 16 "	17	20	22

10. Оформление результатов измерений

Результат измерения представляют в виде , где - характеристика погрешности, , при Р = 0,95, значение рассчитывают по формуле:

, где

Значение приведено в табл. 2.

Примечание. При представлении результата измерений в документах, выдаваемых лабораторией, указывают:

- количество результатов параллельных определений, использованных для расчета результата измерений;

- способ определения результата измерений (среднее арифметическое значение или медиана результатов параллельных определений).

12. Контроль стабильности результатов измерений в пределах лаборатории

Контроль стабильности результатов измерений в пределах лаборатории организуют и проводят в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 [8] и рекомендациями по межгосударственной стандартизации РМГ 76-2004 ГСИ [9].

Периодичность получения результатов контрольных процедур и формы их регистрации приводят в документах лаборатории, устанавливающих порядок и содержание работ по организации методов контроля стабильности результатов измерений в пределах лаборатории.

13. Алгоритм оперативного контроля процедуры измерений с использованием метода добавок

Оперативный контроль процедуры измерений проводят путем сравнения результата отдельно взятой контрольной процедуры с нормативом контроля К.

Результат контрольной процедуры рассчитывают по формуле

, где

- результат измерений массовой концентрации кислоты в пробе с известной добавкой - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (2).

- результат измерений массовой концентрации кислоты в исходной пробе - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет условию (2).

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

, где

, - значения характеристики погрешности результатов измерений, установленные в лаборатории при реализации методики, соответствующие массовой концентрации кислоты в пробе с известной добавкой и в исходной пробе соответственно.

Примечание. Допустимо характеристику погрешности результатов измерений при внедрении методики в лаборатории устанавливать на основе выражения: , с последующим уточнением по мере накопления информации в процессе контроля стабильности результатов измерений.

Процедуру измерений признают удовлетворительной, при выполнении условия:

(5)

При невыполнении условия (5) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (5) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

14. Алгоритм проведения контрольной процедуры при контроле внутрилабораторной прецизионности

Контрольные процедуры при контроле промежуточной прецизионности получают с использованием рабочих проб крови.

При реализации контрольной процедуры получают два результата контрольных измерений (первичного и повторного ) массовой концентрации летучих жирных кислот в условиях внутрилабораторной прецизионности.

Результат контрольной процедуры признают удовлетворительным при выполнении следующего условия:

Значения предела внутрилабораторной прецизионности приведены в табл. 5.

Таблица 5

Значения предела внутрилабораторной прецизионности при доверительной вероятности Р = 0,95

Диапазон измерений,	Предел внутрилабораторной прецизионности (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в одной лаборатории в условиях внутрилабораторной прецизионности), , %
от 0,5 до 1 включ.	28
св. 1 " 16 "	20

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко

______________________________

* Далее по тексту ссылка на номер пункта приложения указывается одним номером в квадратных скобках