Приложение 3. Лабораторные методы исследования

Приложение 3

Лабораторные методы исследования

Перед посевом на питательные среды кусочки вымени отмывают от глицерина стерильным физиологическим раствором и растирают в ступке с небольшим количеством физиологического раствора.

Исследование на наличие патогенного стафилококка

Патогенный стафилококк грамположителен, обладает гемолитическими свойствами, плазмокоагуляцией, сбраживает маннит с образованием газа и при внутрикожном введении кролику вызывает некроз на месте инъекции. Из всех перечисленных свойств патогенного стафилококка свойство коагулировать плазму крови является обязательным.

Определение гемолитических свойств. Патологический материал высевают на кровяной агар в три чашки Петри. В первую чашку вносят 0,1-0,2 мл молока или суспензии, растертого органа. Нанесенный на среду посевной материал распределяют равномерно по поверхности шпателем или согнутой пастеровской пипеткой, затем, не обжигая их, делают дробные пересевы на 2-ю и 3-ю чашки. Посевы инкубируют в термостате при 37°С в течение 18-24 часов.

Выросшие на среде круглые серо-белые влажные колонии с ровными краями, образующие зону гемолиза, вызывают подозрение на наличие патогенного стафилококка. Из такой колонии делают мазок и окрашивают по Граму (стафилококки под микроскопом имеют вид виноградной грозди или кучек, состоящих из нескольких кокков), а также пересевают на МПА, содержащий 0,2% глюкозы, и МПБ для получения чистой культуры и изучения свойств.

Реакция плазмокоагуляции. 8 мл свежеполученной крови кролика смешивают # мл 5%-ного раствора лимоннокислого натра. Плазму, полученную после центрифугирования этой смеси, отсасывают и разводят 1:4 физиологическим раствором, заливают по 0,5 мл в пробирки, количество которых соответствует числу проб, вносят в каждую пробирку пипеткой по 0,1 мл суточной бульонной культуры стафилококка и ставят в термостат при температуре 37°С. Посевы просматривают через 2, 3, 5, 18 и 24 часа. Для контроля плазму оставляют без культуры. В случае положительной реакции плазма свертывается, образуя желеобразный сгусток, а отрицательной - плазма остается жидкой.

Ферментация маннита. 2-3 капли испытуемой бульонной культуры стафилококка засевают в бульон, содержащий 0,5% маннита и индикатор Андрадэ. Можно также пользоваться готовой полужидкой сухой средой с маннитом и индикатором рН. Засеянные пробирки заливают стерильным вазелиновым маслом слоем до 1 см, выдерживают 48 часов в термостате при температуре 37°С. Изменение цвета индикатора и появление пузырьков газа в бродильной трубочке бульона или в толще полужидкого агара указывает на разложение маннита.

Дермонекротическая проба. Суточную культуру смывают с МПА стерильным физиологическим раствором. Концентрацию микробной взвеси доводят по оптическому стандарту до 2 миллиардов микробных тел в 1 мл. В опыт берут кроликов массой 2,5-3 кг. Волосы на боку кролика выстригают, в толщу кожи вводят 0,2 мл культуры (при правильном введении на месте инъекции образуется заметный инфильтрат). Учет результатов проводят ежедневно в течение 5 суток. Положительной реакцией считают появление некроза на месте инъекции. Гиперемия и инфильтрации без некроза рассматривается как отрицательная реакция.

ГАРАНТ:

Нумерация приводится в соответствии с источником

2. Исследование на наличие бактерий маститидис овис

Молоко или суспензию из растертого кусочка вымени высевают по 0,1 мл дробно на сывороточный или кровяной агар в три чашки Петри и инкубируют 24 часа при температуре 37°С. Бактерии маститидис овис, выросшие на этих средах, образуют мелкие округлые голубоватые колонии диаметром 1-2 мм. Через 3-5 дней колонии приобретают сероватый оттенок и вокруг них возникает слизистый ободок. В мазках, окрашенных по Граму, обнаруживают маленькие (1-2 микрометра длины и до 0,5 микрометра толщины) грамотрицательные палочки с округленными краями. При окраске Лефлеровской синькой некоторые палочки окрашиваются биполярно. Микроб спор не образует, неподвижен. Колонии отвивают на пробирки с сывороточным агаром. Выросшую культуру микроскопируют и засевают на сывороточный бульон, на среды с углеводами и многоатомными спиртами, в желатин, молоко и пептонную воду (для образования индола). На простом бульоне эти бактерии растут скудно, образуют легкую муть, на сывороточном - более интенсивно. Через 3-5 дней бульон просветляется и на дне образуется слизистый осадок. На желатине при комнатной температуре роста не дают, молоко не свертывают, большинство штаммов индола не образует. Ферментация углеводов - непостоянный признак. Однако большинство штаммов образует кислоту на средах с глюкозой, сахарозой, мальтозой, ксилозой, сорбитом и не сбраживают лактозу, арабинозу, раффинозу и дульцит. Для лучшего роста возбудителя среды с углеводами готовят на полужидком агаре.

Бактериум маститидис овис убивает белых мышей на 4-5-е сутки при подкожном введении им 0,2-0,5 мл суточной бульонной культуры. Внутрибрюшинное заражение бульонной культурой в количестве 1-2 мл вызывает гибель морских свинок на 3-4-е сутки, кроликов на 5-6-е.

3. В лаборатории выделенные чистые культуры возбудителей мастита проверяют на их чувствительность к антибиотикам согласно "Методическим указаниям по определению чувствительности к антибиотикам возбудителей инфекционных болезней сельскохозяйственных животных".

Приготовление питательных сред для выращивания бактериум маститидис овис

Кровяной и сывороточный агар. Мясопептонный агар рН 7,4-7,6 растапливают и охлаждают до 50°С. Добавляют 5% дефибрированной крови или сыворотки барана, крупного рогатого скота или кролика, смешивают и разливают по чашкам.

Сывороточный бульон. В мясо-пептонный бульон рН 7,4-7,6 добавляют 5% сыворотки крови барана или крупного рогатого скота и стерильно разливают по пробиркам.

Полужидкие среды с углеводами. В 1%-ную пептонную воду рН 7,4-7,7 добавляют 0,15% агара, 0,5% соответствующего углевода и 1% индикатора Андрадэ, разливают по пробиркам и стерилизуют при 0,5 атмосферы 30 минут.