Приложение 2. Лабораторные методы исследования

Приложение 2

Лабораторные методы исследования

1. Определение количества клеток в молоке

а) Метод Прескотта и Брида. Чистое предметное стекло кладут на лист бумаги, расчерченный на квадраты со стороной 1 см. Пробу молока (секрета) тщательно перемешивают, затем микропипеткой наносят на каждый квадрат предметного стекла 0,005 мл молока (секрета) и тщательно распределяют на площади квадрата. Мазок высушивают на воздухе, фиксируют метиловым спиртом или спирт-эфиром (лучше изобутиловым спиртом) в ванночке при вертикальном положении мазка, окрашивают 15-20 минут по Романовскому-Гимза (на 1 мл дистиллированной воды 1-2 капли краски). Вместо краски Романовского-Гимза можно окрашивать мазки по Ньюмансу раствором следующего состава: спирт абсолютный - 50 мл, хлороформ - 50 мл, ледяная уксусная кислота - 20 мл, фуксин основной - 0,1 г, метиленовая синь - 1 г.

Краски растворяют в смеси спирта и хлороформа, нагретой до 50°С. После охлаждения до комнатной температуры в раствор добавляют ледяную уксусную кислоту и выдерживают в течение 18 часов, а затем используют для окрашивания. После окрашивания препарат сушат и промывают трехкратно теплой водой (37-40°С). Мазок тщательно высушивают и просматривают под микроскопом.

В каждом мазке рассматривают по 100 полей зрения. Подсчитанное число клеток умножают на коэффициент для пересчета с учетом объектива и окуляра (для советского микроскопа МБ-1 при объективе 90 и окуляре 7 этот коэффициент равен 6260, при окуляре 10 - 10 200, при окуляре 15 - 33 200).

б) Камерный метод. Подсчету клеток в камере препятствуют жировые шарики, которые необходимо предварительно растворить синтанолом ДС-10.

К 100 мл 0,9%-ного раствора хлористого натрия добавляют 1% формальдегида, 12,5% этилового спирта и 1% синтанола ДС-10 и нагревают при 60°С в течение 20 минут. После растворения добавляют 1% насыщенного спиртового раствора основного фуксина и фильтруют через бумажный фильтр. В связи с тем, что при длительном хранении краситель из раствора выпадает, его добавляют к солюбилизирующему раствору непосредственно перед применением. Раствор солюбилизатора в герметическом сосуде сохраняется длительное время.

Для подсчета клеток в пробирки, содержащие 10 мл солюбилизирующего раствора с красителем, добавляют 0,1 мл молока, тщательно перемешивают и прогревают 30 минут на водяной бане при 80°С. После перемешивания каплю жидкости вносят под покровное стекло счетной камеры Фукса-Розенталя (при отсутствии последней можно использовать камеру Горяева, Тома, Предтеченского, Бюркера и т.д.). Подсчет клеток ведут под микроскопом при объективе 10Х-20Х. В поле зрения на прозрачном фоне видны четко прокрашенные клетки, легко поддающиеся подсчету.

2. Определение каталазы с помощью всплывания диска

Из хроматографической бумаги марки Ф-1 готовят диски диаметром 12 мм. Делают 3%-ный раствор перекиси водорода на 15 М фосфатном буфере pH 7,2 (готовят в день проведения пробы).

Анатомическим пинцетом захватывают бумажный диск и погружают его в тщательно смешанную пробу молока. Для удаления излишков молока диск поворачивают в вертикальное положение и, притрагиваясь к стенкам пробирки, как бы вытирают его. После этого диск погружают в раствор перекиси водорода, которого наливают 5 мл в пробирку размером 60х16 мм. Время, прошедшее от момента погружения диска в раствор до всплытия его на поверхность, отмечают по секундомеру.

При малом содержании клеток в молоке (до 100 тыс./мл) время всплытия диска равно 1-5 минутам, иногда больше.

При увеличении содержания лейкоцитов в молоке свыше 200 тыс./мл диск всплывает за 30-35 секунд. При заболевании маститом диск всплывает за 3-7 секунд или моментально. Данный метод определения каталазы можно использовать при проведении массовых исследований проб молока от коров непосредственно в хозяйствах.

3. Определение лизоцима молока

Из каждой четверти вымени в конце доения в стерильные пробирки надаивают по 5-10 мл молока. На подсушенный МПА (pH 7,2) в чашках Петри (по одной на каждую корову) высевают суточную бульонную культуру золотистого стафилококка штамма ВМ. Для этого культуру разводят физиологическим раствором 1:10 000, по 0,3-0,4 мл равномерно распределяют на агаре в чашках и оставляют на 30-40 минут на горизонтальной поверхности. В агаре каждой чашки делают 4 луночки диаметром 10 мл (пробочником N 5). В каждую луночку вносят стерильной пипеткой по 0,1 мл (2 капли) молока. Чашки выдерживают при комнатной температуре (18-22°С) 18 часов, а затем помещают в термостат на 5-6 часов. Если молоко содержит лизоцим М, то вокруг луночки наблюдается задержка роста стафилококков в виде кольца. По диаметру кольца задержки роста микроба определяют титр лизоцима в молоке. Задержка роста меньше 16 мм - молоко от коровы, больной маститом, 17-24 мм - сомнительное, более 25 мм - от здоровой коровы.

Бактериологическое исследование

Для выявления и дифференциации основных возбудителей маститов необходимо проводить бактериологическое исследование секрета вымени.

Молоко (секрет) для бактериологического исследования отбирают непосредственно после доения в стерильные флаконы или пробирки с ватными пробками с соблюдением правил асептики. Для этого перед взятием молока (секрета) вымя подмывают и вытирают чистым полотенцем. Соски коровы и руки доярки протирают ватным тампоном, смоченным 70%-ным денатурированным спиртом. Нельзя допускать, чтобы сосок касался края посуды. Пробы отправляют в ветеринарную лабораторию, где их исследуют:

1) на чувствительность микрофлоры молока (секрета) к антибиотикам;

2) на наличие основных возбудителей мастита (патогенных стафилококков и агалактийного стрептококка).

Определение чувствительности микрофлоры молока к антибиотикам

Исследуемое молоко с соблюдением стерильных условий разливают по 2 мл в стерильные пробирки. Пробирок должно быть на две больше, чем дисков с антибиотиками.

В одной из пробирок определяют реакцию (pH) молока и добавляют в него 0,1 мл бромтимолблау (раствор бромтимолблау готовят так же, как и для диагностики маститов). В зависимости от pH молока смесь окрашивается от желтого (кислое молоко), салатного, зеленого до синего (щелочное молоко) цвета. Записав результат (цвет смеси), данную пробу исключают из опыта. В оставшиеся пробирки (кроме одной) добавляют по одному диску того или иного антибиотика.

Все пробирки с молоком выдерживают при 37°С в течение 18-20 часов в термостате или автоматически регулируемой водяной бане, после чего во всех пробирках проверяют кислотность молока раствором бромтимолблау.

Если кислотность молока в пробирке без антибиотиков до опыта и после выдерживания в течение 18-20 часов в термостате одинакова, патогенных бактерий в молоке нет. При наличии микрофлоры кислотность молока в пробирке без антибиотиков после выдерживания в термостате увеличивается. В этом случае проверяется кислотность молока в пробирках с антибиотиками.

Если кислотность молока с тем или иным антибиотиком (после выдерживания в термостате) не выше первоначальной (до выдерживания в термостате), значит, бактерии, находящиеся в молоке, высокочувствительны к данному антибиотику. Наоборот, если кислотность молока в пробирках с антибиотиками после выдерживания в термостате увеличивается, из этого следует, что находящиеся в молоке бактерии устойчивы к данному антибиотику, причем чем выше кислотность молока, тем устойчивее микроорганизмы.

Исследование молока (секрета) на наличие патогенных стафилококков и агалактийных стрептококков

Доставленные в лабораторию пробы молока (секрета) после смешивания высевают по 0,1 мл на мясопептонный агар, содержащий 5% отмытых эритроцитов барана (коровы), или на элективные среды: мясопептонный агар, содержащий 7,5% поваренной соли и 5% отмытых эритроцитов барана (коровы), для выделения стафилококков и среду В.М. Карташовой для индикации стрептококков. При отсутствии элективных сред можно использовать только 5%-ный кровяной МПА.

Для получения изолированных колоний 1-2 капли секрета наносят на край пластинки питательной среды в чашке Петри и растирают его по всей пластинке шпателем (согнутая над пламенем пастеровская пипетка). Засеянные чашки (крышкой вниз) выдерживают при температуре 37°С в течение 24 часов. Если на чашках получена однородная по морфологии популяция, для дальнейшего исследования достаточно брать по одной колонии с чашки. Если колонии на чашке различны по форме, размерам, окраске, типу гемолиза, следует брать по одной колонии каждого образца. Отобранные колонии отсевают и подвергают дальнейшему исследованию.

Исследование на наличие стафилококков. Большие и средние колонии белого, кремового и лимонно-желтого цвета, образующие хорошо выраженную зону гемолиза эритроцитов на кровяном агаре или на кровяно-солевом агаре, отсевают в пробирки, содержащие 3 мл мясопептонного бульона (лучше предварительно подогретый в термостате), и выращивают при температуре 37°С в течение 3 - 3 1/2 часов до помутнения.

Выросшие молодые бульонные культуры окрашивают по Граму и микроскопируют. При обнаружении стафилококков определяют их патогенные свойства реакцией плазмокоагуляции, лизоцимную и дезоксирибонуклеазную (ДНК-азной) активность и отношение к манниту, из которых реакции плазмокоагуляции и гемолиза строго обязательны.

Кровяно-солевой агар готовят следующим образом. Готовый (стерилизованный в автоклаве) МПА, содержащий 7,5% хлористого натрия, растапливают и охлаждают до 45°С. Прибавляют 5% отмытых эритроцитов барана или крупного рогатого скота, осторожно перемешивают, чтобы не образовывалось пены, и разливают в чашки Петри. Среду можно хранить в холодильнике в течение нескольких дней.

Реакция плазмокоагуляции служит основным методом определения патогенных стафилококков. Для этого кровь, взятую из сердца кролика, выливают в пробирку со стерильным раствором лимоннокислого натрия и центрифугируют.

Полученную плазму разводят стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:4 и разливают в агглютинационные пробирки по 0,5 мл. 12-18-часовую бульонную культуру испытуемого стафилококка вносят по 2 капли в пробирки с разведенной плазмой. Для контроля в одну пробирку с плазмой не вносят культуры, а в другую засевают заведомо плазмокоагулирующий стафилококк. Пробирки помещают в термостат при 37°С и через каждый час в течение 3 часов учитывают результаты. При положительной реакции образовавшийся сгусток не выпадает из пробирки даже при переворачивании или плавает в плазме.

Кроме того, для выявления патогенных стафилококков применяют и другие методы.

Определение лизоцимной активности стафилококков. В качестве тест-культуры используют взвесь живой или убитой 15-минутным кипячением культуры Micrococcus lysodeicticus. Преимущество использования убитой культуры в том, что в этом случае можно пользоваться стандартным препаратом (взвесь убитых микробов можно хранить в холодильнике в течение месяца и более).

В пробирки с 15 мл растопленного и охлажденного до 50°С 0,7%-ного агара, приготовленного на переваре Хоттингера, вносят взвесь убитой культуры микрококка из расчета 1 млрд микробных клеток на 1 мл среды (по оптическому стандарту). При использовании живой культуры на 1 мл среды добавляют 100 млн микробных тел. Содержимое пробирок выливают в чашки Петри и на поверхность застывшего и подсушенного агара бляшками (размазанная петлей капля) наносят 3-4-часовые бульонные культуры испытуемых штаммов стафилококков. На одной чашке можно испытать 7-8 штаммов.

После инкубации посевов в течение суток при 37°С вокруг бляшек с ростом культур, продуцирующих лизоцим, появляются зоны лизиса, которые значительно увеличиваются после дополнительного пребывания посевов при комнатной температуре в течение 48 часов.

Определение дезоксирибонуклеазной (ДНК-азной) активности стафилококков. К 150 мл расплавленного стерильного готового 2%-ного МПА (pH 8,6) добавляют 300 мг дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), то есть 2 мг/мл, предварительно растворенной в 15 мл подщелоченной 3 каплями 10%-ного раствора едкого натра дистиллированной воды. После перемешивания среду прогревают в течение 1/2 часа в кипящей бане. К немного остывшей среде добавляют 1,2 мл 10%-ного стерильного хлористого кальция, разливают в чашки, подсушивают и засевают бульонными культурами (штрихами). После 18-часовой инкубации при 37°С поверхность чашки заливают 7 мл 1 н. HCl, выдерживают 15 минут, сливают кислоту и учитывают результаты. Появление зон просветления (деполимеризация ДНК) вокруг культур указывает на положительную ДНК-азную реакцию.

Определение отношения к манниту. 3-4 капли испытуемой бульонной культуры стафилококка засевают в пробирку со средой, содержащей 0,5% маннита. В качестве такой среды можно использовать полужидкий агар с индикатором ВР (готовые, сухие среды) или жидкую среду с индикатором Андредэ. Изменение цвета индикатора после 24-часового инкубирования в термостате указывает на ферментацию маннита.

Исследование молока (секрета) на наличие патогенных стрептококков. При учете роста колоний на чашках Петри с кровяным или сывороточным агаром (второй день исследования) отсевают росинчатые мелкие однотипные колонии, характерные для роста стрептококков, на элективную питательную среду для стрептококков (среда В.М. Карташовой), которая готовится следующим образом: к 500 мл МПБ с pH 7,2-7,3 добавляют 2,5 г лактозы, 1 мл спиртового или водного раствора 1:100 бромкрезолпурпура (1 г порошка растворяют в 50 мл спирта и добавляют 50 мл дистиллированной воды). Затем МПБ ставят в водяную баню, доводят до кипения и кипятят 5-7 минут. После остывания до 50-55°С в колбу добавляют 50 мл стерильной сыворотки без консерванта и 0,5 мл раствора неомицина, в котором содержится 25 000 ЕД антибиотика (500 000 ЕД неомицина растворяют в 10 мл физиологического раствора). В стерильных условиях среду разливают по 5 мл в пробирки. Цвет ее сине-фиолетовый. Посевы инкубируют в течение 24 часов при 37°С.

Изменение сине-фиолетового цвета среды в лимонный или желто-зеленый указывает на рост стрептококков. Из пробирок с измененным цветом среды готовят мазки и окрашивают по Граму. При наличии стрептококков проводят их дальнейшую дифференциацию с помощью КАМП-теста.

Постановка КАМП-теста. Суточную культуру бета-гемолитического стафилококка высевают на агар с 5% крови крупного рогатого скота или барана. Посев делают петлей сплошной линией по диаметру чашки. Перпендикулярно к линии посева стафилококка, не доходя 5-6 мм, высевают ровным штрихом испытуемую культуру стрептококков. На одной чашке можно проверить 8-10 культур. Чашки помещают в термостат на 24 часа при 37°С. КАМП-тест считается положительным, если четко выражен гемолиз испытуемого стрептококка в виде усеченного треугольника или полукруга в зоне бета-гемолитического стафилококка.

Положительный КАМП-тест дают только агалактийные стрептококки. На этих же чашках кровяного агара учитывают и тип гемолиза стрептококков. Светлая зона вокруг штриха культуры стрептококков указывает на бета-гемолиз, зеленая зона - на альфа-гемолиз (зеленящие стрептококки).

Для дифференциации непатогенных стрептококков (группа D-фекальные стрептококки и группа N-молочнокислые стрептококки) делают высевы на бульон с 6,5% хлористого натрия, на бульон с 40% желчи крупного рогатого скота и на стерильное обезжиренное молоко с добавлением метиленовой сини 1:1000 (на 5 мл молока 0,5 мл 1%-ного раствора метиленовой сини). Посевы инкубируют в термостате при 37°С и на другой день проводят учет по следующей схеме:

Серологический тип	Наименование стрептококка	Гемолиз		КАМП-тест	Среда Карташовой	МПБ с 6,5% желчи	МПБ с 40% желчи	Молоко с метиленовой синью 1:1000	МПБ с 0,5% сорбита
А	Str. pyogenes	-	+	-	+	-	-	-	-
B	Str. agalactiae			+	+	-		-	-
C	Str. dysgalactiae	+	-	-	+	-	-	-
Е	Str.	-	+	-	+	-		-	+
D	Str. faecalis	-		-	+	+	+	+
N	Str. lactis		-	-	-	-	+		-
N	Str. cremoris		-	-	-	-	-	+	-

Исследование молока на наличие кишечных палочек

Колонии грамотрицательных палочек с кровяного агара отсевают на элективную среду КОДА и инкубируют при 37°С в течение 24 часов. Изменение сине-фиолетового цвета до желто-зеленого указывает на наличие бактерий группы кишечных палочек.

Для подтверждения диагноза следует отобрать пробы молока вторично и исследование повторить. Вторичное обнаружение кишечных палочек в молоке подтверждает их этиологическую роль в воспалительном процессе вымени.

Для идентификации микроорганизмов делают высевы с жидкой среды КОДА на МПА с целью получения отдельных колоний.

При необходимости установления рода бактерий выделенные микроорганизмы исследуют по тестам ТЛИМАЦ (температурный тест, сбраживание лактозы, индолообразование, реакции с метилрот и на ацетоин, способность утилизировать цитраты). С целью выделения энтеропатогенных штаммов кишечных палочек используют О-коли сыворотки, согласно "Наставлению по бактериологической диагностике колибактериоза сельскохозяйственных, промысловых животных и птиц", утвержденному Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 8 января 1974 г.