Приложение IV. Африканская чума лошадей. Диагностика

Приложение IV

Африканская чума лошадей
Диагностика

Реагенты для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), описанного ниже, можно получить в Эталонной лаборатории Европейского Сообщества или эталонных лабораториях Международного эпизоотического бюро по африканской чуме лошадей.

1. Конкурентный анализ ELISA для выявления антител к вирусу африканской чумы (AHVS) лошадей (установленный тест)

Для выявления специфических антител к AHVS в сыворотках от видов лошадиных используют конкурентный ELISA. Поликлональная, иммунная анти-AHVS сыворотка морских свинок широкого спектра действия (далее "антисыворотка морских свинок") является специфичной в отношении серогрупп, и способна выявить все известные серотипы вируса AHS.

Принцип теста заключается в прерывании реакции между антигеном AHVS и антисывороткой морской свинки при помощи образца тест-сыворотки. Антитела к AHVS в образце тест-сыворотки будут конкурировать с антителами в антисыворотке морской свинки, что приводит в результате к редуцированию ожидаемого цвета (после добавления меченых ферментом антител против морских свинок и субстрата). Сыворотки можно проверить в разовом разведении 1 к 5 (капельный метод) или титровать (метод титрования сывороток), чтобы получить конечные точки разведения. Показатели ингибирования выше 50% можно считать положительными.

Протокол тестирования, описанный далее в настоящем документе, используется в Региональной эталонной лаборатории по африканской чуме лошадей в Пирбрайте (Соединенное Королевство).

1.1. Процедура тестирования

1.1.1. Подготовка планшетов

1.1.1.1. Сенсибилизировать планшеты ELISA антигеном AHVS, экстрагированным из зараженных культур клеток и разведенных в карбонатном/бикарбонатном буфере, рН 9,6. Инкубировать планшеты ELISA в течение ночи при температуре 4°C.

1.1.1.2. Промыть планшеты три раза фосфатно-буферным раствором (ФБР), рН 7,2 - 7,4 рН, промокнуть насухо абсорбирующей бумагой.

1.1.2 Контрольные лунки

1.1.2.1 Титровать положительные контрольные сыворотки в серии двукратного разведения от 1 к 5 до 1 к 640 по колонке 1 в блокирующем буфере (PBS, содержащий 0,05% (о/о) Твин-20, 5,0% (в/о) сухого обезжиренного молока (Cadbury's Marvel TM) и 1% (о/о) сыворотки от взрослой коровы), чтобы полученный конечный объем составил 50 мкл/лунку

1.1.2.2 Добавить 50 мкл отрицательной контрольной сыворотки, разведенной 1 к 5 (10 мкл сыворотки + 40 мкл блокирующего буфера), в лунки А и В колонки 2.

1.1.2.3. Добавить 100 мкл/лунку блокирующего буфера в лунки С и D колонки 2 (пустая).

1.1.2.4. Добавить 50 мкл блокирующего буфера в лунки E, F, G и Н колонки 2 (контрольная морская свинка).

1.1.3 Капельный метод

1.1.3.1 Добавить разведение 1 к 5 каждой тест-сыворотки в блокирующий буфер, чтобы удвоить лунки колонок 3 - 12 (10 мкл сыворотки + 40 мкл блокирующего буфера).

Или

1.1.4 Метод титрования сыворотки

1.1.4.1 Приготовить серию двукратного разведения каждого образца для испытания (1 к 5 до 1 к 640) в блокирующем буфере через 8 лунок отдельных колонок (3 до 12).

Затем

1.1.5. Добавить 50 мкл антисыворотки морских свинок, предварительно разведенных в блокирующем буфере, во все лунки за исключением пустых лунок планшета ELISA (все лунки сейчас содержат конечный объем 100 мкл).

1.1.5.1. Инкубировать на 1 час при 37°C на орбитальном шейкере.

1.1.5.2. Промыть планшеты три раза и промокнуть досуха, как ранее.

1.1.5.3. Добавить 50 мкл конъюгата пероксидазы хрена с антителами кролика против иммуноглобулина морской свинки, который был предварительно разведен в блокирующем буфере в каждой лунке.

1.1.5.4. Инкубировать на 1 час при 37°C на орбитальном шейкере.

1.1.5.5. Промыть планшеты три раза и промокнуть насухо, как ранее.

1.1.6 Хромоген

Приготовить раствор хромогена (ортофенилдиамина ОФД) в соответствии с инструкциями производителя (0,4 мг/мл в стерильной дистиллированной воде) непосредственно перед использованием. Добавить субстрат (перекись водорода ), чтобы получить итоговую концентрацию 0,05% (о/о) (1 к 2000 30% раствора ). Добавить 50 мкл ОФД раствора в каждую лунку и оставить планшеты на рабочей поверхности на 10 минут при средней температуре. Остановить реакцию путем добавления 50 мкл/лунку 1М серной кислоты ().

1.1.7 Считывание результатов

Спектрофотометрическое считывание результатов при 492 нм.

1.2 Выражение результатов

1.2.1 Используя пакет программного обеспечения, распечатайте показатели оптической плотности (OD), процентного ингибирования (PI) для тестовых и контрольных сывороток на основе среднего показателя, записанного в четырех контрольных лунках с сыворотками от морских свинок. Сведения, выраженные через показатели OD и PI, используют для определения того, проведен ли тест в допустимых пределах. Верхние контрольные пределы (UCL) и нижние контрольные пределы (LCL) варьируются в промежутке показателей OD от 1,4 до 0,4 соответственно. Титр в конечной точке для положительного контроля, основанный на 50% ингибировании, должен быть 1 к 240 (в рамках от 1 к 120 до 1 к 480). Любой планшет, который не соответствует вышеупомянутым критериям, следует отбраковать. Однако если показатель титра положительной контрольной сыворотки больше чем 1 к 180 и образцы для тестирования по-прежнему отрицательные, тогда можно принять отрицательные образцы для тестирования.

Лунки с отрицательной контрольной сывороткой в двух повторах и пустые лунки в двух повторах должны фиксировать показатели PI между +25% и -25%, между +95% и 105% соответственно. Невозможность оказаться в этих пределах не позволяет считать планшет недействительным, но показывает образование фонового цвета.

1.2.2 Диагностический порог (точка разделения) для тест-сывороток составляет 50% (PI 50%).

Образцы, фиксирующие PI показатели больше 50%, учитывают как положительные. Образцы, которые фиксируют PI показатели ниже 50%, записывают как отрицательные. Образцы, которые фиксируют PI показатели выше и ниже порога для лунок в двух повторах, считают сомнительными. Такие образцы можно повторно протестировать капельным методом и путем титрования. Положительные образцы можно также титровать, чтобы определить показатель степени положительности.

План капельного метода

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	+ve cont.		Тест-сыворотки
A	1:5	-ve cont.	31	32	33	34	35	36	37	38	39	40
B	1:10	-ve cont.	31	32	33	34	35	36	37	38	39	40
С	1:20	Пустая
D	1:40	Пустая
E	1:80	GP cont.
F	1:160	GP cont.
G	1:320	GP cont.	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
H	1:640	GP cont.	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
-ve cont - негативный контроль +ve cont - позитивный контроль GP cont. - контроль морской свинки

Тест-сыворотка

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

+ve cont.

Тест-сыворотки

A

1:5

-ve cont.

1:5

1:5

B

1:10

-ve cont.

1:10

1:10

С

1:20

Пустая

1:20

1:20

D

1:40

Пустая

1:40

1:40

E

1:80

GP cont.

1:80

1:80

F

1:160

GP cont.

1:160

1:160

G

1:320

GP cont.

1:320

1:320

H

1:640

GP cont.

1:640

1:640

-ve cont - негативный контроль +ve cont - позитивный контроль GP cont. - контроль морской свинки

2. Непрямой ELISA для выявления антител к вирусу африканской чумы лошадей (установленный тест)

Описанный ниже анализ соответствует описанию в Главе 2.1.11 Руководства МЭБ по стандартам для диагностических тестов и вакцин, 4 издание, 2000 г.

Рекомбинантный белок VP7 был использован в качестве антигена для выявления антител против вируса AHS с высоким индексом чувствительности и специфичности. Другие преимущества белка заключаются в том, что он стабилен и не является инфекционным.

2.1. Процедура тестирования

2.1.1. Твердая фаза

2.1.1.1. Планшеты ELISA сенсибилизируют рекомбинантным VP7 AHVS-4, разведенным в карбонатном/бикарбонатном буфере, рН 9,6. Инкубировать планшеты в течение ночи при 4°C.

2.1.1.2. Промыть планшеты пять раз, используя дистиллированную воду, содержащую 0,01% (о/о) Твин 20 (промывочный раствор). Аккуратно встряхните планшет над абсорбирующим материалом, чтобы удалить остатки промывочного раствора.

2.1.1.3. Блокировать планшеты фосфатно-буферным раствором (ФБР) +5% (в/о) обезжиренного молока (Nestle Dry Skim Milk TM), 200 мкл/лунку на 1 час при 37°C.

2.1.1.4. Удалите блокирующий раствор и аккуратно встряхните планшет над абсорбирующим материалом.

2.1.2. Образцы для испытаний

2.1.2.1. Образцы сыворотки, которые необходимо протестировать, положительные и отрицательные контрольные сыворотки, разведены 1 к 25 в ФБР +5% (в/о) обезжиренного молока +0,05% (о/о) Твин 20, 100 мкл на лунку. Инкубировать на 1 час при 37°C.

Для проведения титрования приготовьте серию двукратного разведения из 1 к 25 (100 мкл/лунку), одна сыворотка на колонку планшета, сделать то же самое с положительными и отрицательными контролями. Инкубировать на 1 час при 37°C.

2.1.2.2. Промыть планшеты, как описано на этапе 2.1.1.2.

2.1.3. Конъюгат

2.1.3.1. Разлить 100 мкл/лунку конъюгированный пероксидазой хрена антилошадиный гамма-глобулин, разведенный в ФБР + 5% молоко Твин 20, рН 7,2. Инкубировать на час при 37°C.

2.1.3.2.Промыть планшеты, как описано в пункте 2.1.1.2.

2.1.4. Хромоген/Субстрат

2.1.4.1. Добавить 200 мкл/лунку раствора хромоген/субстрат (10 мл 80,6 мМ DMAB (диметиламинобензальдегида) +10 мл 1,56 мМ МВТН (3-метил-2-бензтиазолинон-гидразон гидрохлорида )+5 мкл ).

Проявление цвета останавливается при добавлении 50 мкл после приблизительно 5 - 10 минут (до тех пор, как отрицательный контроль начинает окрашиваться).

Можно также использовать другие хромогены. Например, ABTS (2,2'-азино-бис (3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты)), ТМВ (тетраметилбензидин), или OPD (ортофенилдиамин).

2.1.4.2. Снимите показатели с планшетов при 600 нм (или 620 нм).

2.2 Интерпретация результатов

2.2.1. Рассчитать значение точки разделения путем добавления 0,6 к показателю отрицательного контроля (0,6 стандартное отклонение, полученное с группой 30 отрицательных сывороток).

2.2.2. Образцы для тестирования, дающие показатели абсорбции ниже, чем точка разделения, считают отрицательными.

2.2.3. Образцы для тестирования, дающие показатели абсорбции больше, чем точка разделения +0,15 считают положительными.

2.2.4. Образцы для тестирования, дающие средние показатели абсорбции, являются сомнительными, и следует использовать второй метод, чтобы подтвердить результат.

3. Блокирующий ELISA для выявления антител к вирусу африканской чумы лошадей (AHSV) (установленный тест)

Блокирующий ELISA разработан, чтобы выявить специфические антитела к вирусу африканской чумы лошадей в сыворотках от восприимчивых видов. VP7 является основным антигенным вирусным белком AHSV и сохраняется в девяти серотипах. Так как моноклональные антитела также выявляют против VP7, то проба даст более высокий уровень чувствительности и специфичности. Далее, антиген рекомбинантного белка VP7 является абсолютно нетоксичным, следовательно, гарантирует высокую степень безопасности.

Принцип теста заключается в прерывании реакции между рекомбинантным VP7 как антигеном, связанным с планшетом ELISA, и конъюгированными антителами, специфичными для VP7. Антитела в тестовых сыворотках заблокируют реакцию между антигеном и моноклональными антителами, что приводит в результате к редукции цвета.

Тест, описанный далее в настоящем документе, проводят в Эталонной лаборатории Европейского Сообщества по африканской чуме лошадей в Альхете, Испания.

3.1. Процедура тестирования

3.1.1. Планшеты ELISA

3.1.1.1. Сенсибилизировать планшеты ELISA рекомбинантным VP7 AHSV-4, разведенным в карбонатном/бикарбонатном буфере, рН 9,6. Инкубировать в течение ночи при 4°C.

3.1.1.2. Промыть планшеты пять раз фосфатно-буферным раствором (ФБР), содержащим 0,05% (о/о) Твин 20 (ФБРТ).

3.1.1.3. Провести стабилизацию планшета путем его обработки стабилизирующим раствором (чтобы обеспечить долгосрочное хранение при 4°C без потери активности) и промокнуть насухо абсорбирующим материалом.

3.1.2. Образцы для тестирования и контрольные

3.1.2.1 для скрининга	развести тест-сыворотки и контрольные сыворотки 1 к 10 прямо на планшете в ФБРТ, чтобы получить итоговый объем 100 мкл/лунку. Инкубировать на 1 час при 37°C.
3.1.2.2 для титрования	подготовить серию двукратного разведения тест-сывороток и положительных контрольных сывороток (100 мкл/лунку) с 1 к 10 до 1 к 280 через 8 лунок. Отрицательный контроль проверяют при разведении 1 к 10.

3.1.3. Конъюгат

Добавить 50 мкл/лунку предварительно разведенных моноклональных антител, конъюгированных пероксидазой хрена (моноклональные антитела, специфические к VP7) в каждую лунку и аккуратно перемешать до получения однородной массы. Инкубировать в течение 30 минут при 37°C.

3.1.4. Промыть планшеты пять раз при помощи ФБРТ и промокнуть насухо.

3.1.5. Хромоген/Субстрат

Добавить 100 мкл/лунку раствора хромоген/субстрат (1 мл ABTS (2,2'-азино-бис 3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты) 5 мг/мл + 9 мл субстратного буфера (0,1 М фосфат-цитратный буфер с рН 4, содержащий 0,03% )) и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.

Проявление цвета остановить путем добавления 100 мкл/лунку 2% (в/о) SDS (додецилсульфата натрия).

3.1.6. Считывание результатов

Считать при 405 нм с помощью ELISA-ридера

3.2. Интерпретация результатов

3.2.1 Валидация анализа

Тест является валидным, когда оптическая плотность (OD) отрицательного контроля (ОК) выше 1,0 и OD положительного контроля (ПК) ниже 0,2.

3.2.2. Расчет точки разделения

Положительная точка разделения = ОК - ((ОК-ПК) х 0,3)

Отрицательная точка разделения = ОК - ((ОК-ПК) х 0,2)

Где ОК является OD отрицательного контроля и ПК является OD положительного контроля.

3.2.3. Интерпретация результатов

Образцы с OD ниже, чем положительная точка разделения, необходимо считать положительными к антителам против вируса AHS.

Образцы с OD выше, чем отрицательная точка разделения, необходимо считать отрицательными к антителам против вируса AHS.

Образцы с OD между этими двумя показателями следует считать сомнительными, и следует повторно взять у животных образцы после 2 - 3 недель.