Приложение В (обязательное). Методики приготовления культуральных сред и реактивов

Приложение В
(обязательное)

Методики
приготовления культуральных сред и реактивов

В.1 Лактозный ТТХ агар с гептадецилсульфатом натрия (среда с тергитолом 7)

В.1.1 Базовая среда

Состав:

лактоза - 20 г;

пептон - 10г;

дрожжевой экстракт - 6 г;

мясной экстракт - 5 г;

бромтимоловый синий - 0,05 г;

агар (в форме порошка или хлопьев) - 15 - 20 г;

дистиллированная вода - 1000 мл.

Примечание - Массу агара выбирают в зависимости от его свойств к гелеобразованию.

Растворяют все указанные ингредиенты в дистиллированной воде при нагревании. Устанавливают значение рН таким образом, чтобы после стерилизации оно было равно (7,20,1) при температуре 25 °C.

Разливают полученную среду в емкости вместимостью не более 250 мл и стерилизуют в течение 15 мин при температуре (1213) °C.

В.1.2 Раствор 2, 3, 5-трифенилтетразолиум хлорида (ТТХ)

Состав:

2, 3, 5-трифенилтетразолиум хлорид (ТТХ) - 0,05 г;

дистиллированная вода - 100 мл.

Растворяют ТТХ в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем дистиллированной водой до 100 мл. Стерилизуют раствор фильтрацией через мембрану с номинальным размером пор 0,2 мкм.

В.1.3 Раствор гептадецилсульфата натрия

Состав:

гептадецилсульфат натрия (тергитол 7) - 0,2 г;

дистиллированная вода - 100 мл.

Растворяют гептадецилсульфат натрия (тергитол 7) в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем дистиллированной водой до 100 мл. Раствор стерилизуют в течение 15 мин при температуре (1213)°C.

В.1.4 Среда полного состава

Состав:

базовая среда (см. В.1.1) - 100 мл;

раствор ТТХ (см. В.1.2) - 5 мл;

раствор гептадецилсульфата натрия (см. В.1.3) - 5 мл.

Расплавляют базовую среду (см. В.1.1) и охлаждают до температуры (50 5) °C. Соблюдая стерильность, добавляют в колбу с охлажденной базовой средой растворы ТТХ (см. В.1.2) и гептадецилсульфата натрия (см. В.1.3), тщательно перемешивают, избегая образования пузырей, затем разливают в чашки Петри с образованием слоя толщиной не менее 5 мм. Полученную среду хранят в защищенном от света месте при температуре (5 3)°C не более 10 сут.

В.2 Триптофановый бульон

Состав:

казеин трипсиновой ферментации - 10 г;

L-триптофан - 1 г;

натрий хлористый - 5 г;

дистиллированная вода - до 1000 мл.

Указанные ингредиенты растворяют при нагревании в дистиллированной воде и разливают по 3 мл в пробирки. Затем стерилизуют в течение 15 мин при температуре (1213) °C. Значение рН готовой к использованию среды - (7,50,1) при температуре 25 °C.

Примечание - Если результаты контроля*(7) качества среды показывают достаточное количество L-триптофана в используемом казеине трипсиновой ферментации, то его в среду не добавляют, а дополнительно вносят 10 г казеина трипсиновой ферментации.

В.3 Неселективный триптон-соевый агар (ТСА)

Состав:

казеин трипсиновой ферментации -15 г;

соевый пептон -5 г;

натрий хлористый -5 г;

агар (в форме порошка или хлопьев) -15-г;

дистиллированная вода -до 1000 мл.

Примечание - Массу агара выбирают в зависимости от его свойств к гелеобразованию.

Указанные ингредиенты растворяют при нагревании в дистиллированной воде. Устанавливают значение рН таким образом, чтобы после стерилизации оно было равно (7,20,1) при температуре 25 °C. Разливают полученную среду в емкости вместимостью не более 250 мл и стерилизуют в течение 15 мин при температуре (1213) °C. Затем среду охлаждают при комнатной температуре до (505) °C и разливают в чашки Петри с образованием слоя толщиной не менее 5 мм.

Примечания

1 Для оксидазного теста вместо ТСА может применяться любой неселективный агар с низким содержанием ферментируемых углеводов.

2 Для приготовления двуслойной среды вместо ТСА может быть использован питательный агар (приготовленный в соответствии с инструкцией изготовителя) с добавлением L-триптофана в концентрации 1 .

В.4 Триптон-желчный агар (ТЖА)

Состав:

триптон - 20 г;

соли желчи - 1,5 г;

агар (в форме порошка или хлопьев) - 15 - 25 г;

дистиллированная вода - до 1000 мл.

Примечание - Массу агара выбирают в зависимости от его свойств к гелеобразованию.

Указанные ингредиенты растворяют при кипячении в дистиллированной воде. Устанавливают значение рН таким образом, чтобы после стерилизации оно было равно (7,20,1) при температуре 25 °C. Разливают среду в емкости вместимостью не более 250 мл и стерилизуют в течение 15 мин при температуре (1213) °C. Затем среду охлаждают при комнатной температуре до (505) °C и разливают в чашки Петри с образованием слоя толщиной не менее 5 мм.

Чашки с двуслойной средой готовят путем заливки горячего ТСА (см. В.3) температурой (505) °C поверх затвердевшей среды ТЖА, разлитой в чашки, нагретые до комнатной температуры. Используют такой объем ТСА, который образует слой толщиной около 1 мм (например 2,5 мл в чашке Петри диаметром 55 мм). После затвердения двуслойной среды, при необходимости, ее подсушивают в термостате при температуре (362) °C, перевернув чашки вверх дном. Для каждого анализа готовят свежие двуслойные среды (за 30 - 60 мин до размещения мембранных фильтров в чашках Петри со средой).

В.5 Реактивы

В.5.1 Реактив Ковача для индольного теста (стандартный тест)

Состав:

p-диметиламинобензальдегид - 5 г;

амиловый или бутиловый спирт (не содержащий органических оснований) - 75 мл;

соляная кислота плотностью 1,18 г/мл - 25 мл.

Растворяют альдегид в спирте. Осторожно добавляют концентрированную соляную кислоту. Реактив хранят при температуре (5 3) °C в защищенном от света месте.

Примечания

1 Цвет реактива должен быть от светло-желтого до светло-коричневого; при использовании амилового спирта неудовлетворительного качества реактив приобретает темную окраску.

2 Приготовление реактива проводят в вытяжном шкафу. При этом необходимо использовать защитные перчатки и очки и избегать контакта с p-диметиламинобензальдегидом. Амиловый спирт может вызывать раздражение слизистых оболочек и головокружение.

В.5.2 Реактив для индольного теста (ускоренный тест)

Состав:

p-диметиламинобензальдегид - 0,5 г;

соляная кислота молярой концентрации 1 моль/л - 100 мл.

Растворяют p-диметиламинобензальдегид в соляной кислоте (по В.5.1, примечание 2).

Реактив хранят в непрозрачной емкости при температуре (5 3) °C. Реактив должен быть светло-желтого цвета; если цвет становится коричневато-желтым, реактив не используют.

В.5.3 Реактив для оксидазного теста

Вариант 1.

Состав:

тетраметил-p-фенилендиамин гидрохлорид - 0,1 г;

дистиллированная вода - 10 мл.

Реактив нестабилен, и его необходимо готовить непосредственно перед испытаниями и сразу же использовать. Хранить реактив не допускается.

Вариант 2.

Состав:

1%-ный спиртовой раствор -нафтола (раствор N 1);

1%-ный водный раствор диметил-p-фенилендиамина дигидрохлорида (раствор N 2).

Срок хранения растворов в емкостях из темного стекла с притертыми пробками составляет: не более 1 мес - раствора N 1; не более 7 сут - раствора N 2.

Перед использованием для испытания реактив для оксидазного теста готовят следующим образом: к 2,5 частям раствора N 1 добавляют 7,5 частей раствора N 2.

Примечания

1 Все перечисленные реактивы являются канцерогенными. Работу по приготовлению реактивов следует выполнять в вытяжном шкафу, используя защитные перчатки и избегая контакта реактива с кожей.

2 Для постановки оксидазного теста допускается использовать коммерческие тест-системы.