Методические указания МУК 4.1.2863-11 "Определение остаточных количеств Пропизахлора в воде, повче, зеленой массе, зерне, кукурузе, семенах подсолнечника, рапса и растительном масле методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ 31 марта 2011 г.)

Методические указания МУК 4.1.2863-11
"Определение остаточных количеств Пропизахлора в воде, повче, зеленой массе, зерне, кукурузе, семенах подсолнечника, рапса и растительном масле методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом РФ 31 марта 2011 г.)

Дата введения: с момента утверждения

Общие положения и область применения

Свидетельство об аттестации методики от 25.06.2010 N 01.5.04.685.

Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств Пропизахлора в воде в диапазоне концентраций 0,002-0,02 мг/кг, в почве, зеленой массе и зерне кукурузы, семенах подсолнечника и рапса в диапазоне концентраций 0,025-0,25 мг/кг, в растительном масле 0,05-0,5 мг/кг.

1. Краткая характеристика препарата

Действующее вещество: Пропизахлор.

Структурная формула:

Название действующего вещества по ИЮПАК: 2-хлор-6'-этил-N-изопропоксиметилацето-о-толуидин.

Эмпирическая формула: .

Молекулярная масса: 283,8.

Химически чистое вещество: маслянистая жидкость от светло-коричневого до пурпурного цвета с характерным запахом.

Температура плавления: 21,6°С.

Давление пара при 20°С: 4 мПа.

= 3,50 (20°С).

Растворимость в воде 184 . Растворим в большинстве органических растворителей. Гидролитически стабилен. Через 5 дней хранения при 50°С (рН 4, 7, 9) степень разложения составляет менее 10%.

Краткая токсикологическая характеристика: острая оральная токсичность для крыс 3 433 мг/кг (мужские особи) и 2 088 мг/кг (женские особи). Дермальная токсичность превышает 2 000 мг/кг, а ингаляционная - 5 000 для животных обоих полов (крысы).

Область применения: Пропизахлор - селективный гербицид для регулирования роста однолетних трав и некоторых широколистных сорняков на почвах кукурузы, подсолнечника, сои, картофеля и гороха.

Механизм действия заключается в ингибировании деления клеток посредством блокирования белкового синтеза при адсорбции гербицида на корнях прорастающих растений.

Гигиенические нормативы для Пропизахлора в России не установлены.

2. Методика определения Пропизахлора в воде, почве, зеленой массе, зерне кукурузы, семенах подсолнечника, рапса и растительном масле методом ВЭЖХ

2.1. Основные положения

2.1.1. Область применения и принцип метода

Настоящие методические указания устанавливают метод определения остаточных количеств Пропизахлора в воде водоемов в диапазоне концентраций 0,002 - 0,01 мг/кг, в почве, зеленой массе, зерне кукурузы, семенах подсолнечника и рапса в диапазоне концентраций 0,025 - 0,25 мг/кг и в растительном масле - 0,05 - 0,5 мг/кг.

Методика основана на определении Пропизахлора методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов водным ацетоном или ацетонитрилом с последующей очисткой на концентрирующих патронах.

2.1.2. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р=0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Диапазон измерений, массовая концентрация	Показатель повторяемости (относительное средне-квадратическое отклонение повторяемости), , %	Показатель промежуточной прецизионности (относительное среднеквадратическое отклонение в условиях вариации факторов "время", "оператор" в одной лаборатории), , %	Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости), , %	Показатель точности* (границы относительной погрешности при вероятности Р = 0,95), , %
1	2	3	4	5
Вода,
от 0,002 до 0,01 вкл.	5	6	7	15
св. 0,01 до 0,02 вкл.	4	5	6	13
Почва, мг/кг
от 0,025 до 0,1 вкл.	6	7	8	16
св. 0,1 до 0,25 вкл.	5	6	7	15
Зерно кукурузы, мг/кг
от 0,025 до 0,1 вкл.	4	4	5	10
св. 0,1 до 0,25 вкл.	3	3	4	8
Семена подсолнечника, мг/кг
от 0,025 до 0,1 вкл.	5	7	8	15
св. 0,1 до 0,25 вкл.	3	4	5	9
Семена рапса, мг/кг
от 0,025 до 0,1 вкл.	6	8	9	18
св. 0,1 до 0,25 вкл.	3	4	5	10
Зеленая масса (кукурузы, рапса), мг/кг
от 0,025 до 0,1 вкл.	5	7	8	16
св. 0,1 до 0,25 вкл.	3	3	4	8
Растительное масло, мг/кг
от 0,05 до 0,1 вкл.	5	7	8	16
св. 0,1 до 0,5 вкл.	3	3	4	8
* Соответствует расширенной неопределенности (в относительных единицах) при коэффициенте охвата k = 2.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 2

Полнота извлечения Пропизахлора, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для n = 20, Р = 0.95

Анализируемый объект	Предел обнаружения	Диапазон определяемых концентраций	Среднее значение определения, %	Стандартное отклонение, S, %	Доверительный интервал среднего результата, %
Вода,	0,002	0,002 - 0,02	93,75	4,5	9,0
Почва, мг/кг	0,025	0,025 - 0,25	83,8	4,9	9,8
Зерно кукурузы, мг/кг	0,025	0,025 - 0,25	87,3	4,4	8,8
Семена подсолнечника, мг/кг	0,025	0,025 - 0,25	85,4	4,8	9,4
Семена рапса, мг/кг	0,025	0,025 - 0,25	83,0	4,3	8,4
Зеленая масса кукурузы, мг/кг	0,025	0,025 - 0,25	85,6	4,7	9,2
Растительное масло, мг/кг	0,05	0,05 - 0,5	80,5	4,3	8,4

2.1.3. Избирательность метода

Избирательность метода определения Пропизахлора достигается сочетанием условий подготовки проб и хроматографического анализа.

2.2. Реактивы и материалы

Ацетон, осч,	ТУ 6-09-3513-86
Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-200нм", сорт 5 или хч	ТУ 6-09-3534-87
Бумажные фильтры "красная лента"	ТУ 6.091678-86
Вода бидистиллированная, деионизированная	ГОСТ 6709-79
Пропизахлор, аналитический стандарт с содержанием д.в. 98,4% (HPLC) Riedel-de Наёn
Кислота ортофосфорная, хч, 0,005 М
водный раствор	ГОСТ 6552-80
н-Гексан, хч, свежеперегнанный	ТУ 2631-003-05807999-98
Диэтиловый эфир, чда, (Вектон)	ТУ 2600-001-43852015-02
Калия гидроксид, чда (Lachema/Chemapol)
Подвижная фаза для ВЭЖХ: 1) смесь ацетонитрила и 0,005 М Н3Р04 в соотношении 53:47; 2) смесь ацетонитрила и 0,005 М в соотношении 60:40
Концентрирующие патроны, заполненные силикагелем 60 (0,040 - 0,063 mm), фирма "Merck"
Концентрирующие патроны Диапак С16 (0,4 г), фирма "БиоХимМак"

Допускается использование реактивов и материалов с характеристиками не хуже указанных.

2.3. Приборы и посуда

Жидкостный хроматограф "ACQUITY" фирмы "Waters" с быстросканирующим УФ-детектором, снабженным дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или "Breeze" фирмы "Waters" или аналогичный Аналитические колонки: 1 - ACQUITY UPLC ВЕН Phenyl (100 х 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters); 2 - ACQUITY UPLC ВЕН С18 (100 х 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters)	ТУ 3.836.008
Баня ультразвуковая "Серьга", или аналогичная	ТУ 3.836.008
Весы аналитические ВЛА-200, или аналогичные	ГОСТ 24104-2001
Воронка Бюхнера, Мельница ножевая РМ-120 и	ГОСТ 0147
лабораторная зерновая ЛМЗ,	ТУ 1-01-0593-79
Насос водоструйный,	ГОСТ 10696-75

ГАРАНТ:

Взамен ГОСТ 10696-75 постановлением Госстандарта СССР от 15 июля 1982 г. N 2670 с 1 января 1984 г. введен в действие ГОСТ 25336-82

Центрифуга ОПн-8УХЛ4.2, Бидистиллятор Аллонж прямой с отводом для вакуума (для работы с концентрирующими патронами)	ТУ 5.375-4261-76
Шприц медицинский с разъемом Льюера	ГОСТ 22090
РН-метр универсальный ЭВ-74	ГОСТ 22261-76

ГАРАНТ:

См. ГОСТ 22261-94 "Средства измерений электрических и магнитных величин. Общие технические условия", утвержденный постановлением комитета РФ по стандартизации, метрологии и сертификации от 15 мая 1995 г. N 250

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС	ГОСТ 10384-72
Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29/32 ТС	ГОСТ 10384-72
Воронки лабораторные В-75-110	ГОСТ 25 336-82
Цилиндры мерные на 100, 250 и 1 000	ГОСТ 1774-74
Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1 000	ГОСТ 1770-74
Пипетки на 1,2, 5, 10	ГОСТ 22292-74
Микродозаторы Ленпипет переменного объема от 200 до 1 000 и от 1 до 5

Допускается использование средств измерения и вспомогательного оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

2.4. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ 29168-89 "Почвы. Отбор проб", ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб". Для длительного хранения пробы почвы подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности, просеивают через сито с отверстиями 1 мм.

Зеленую массу замораживают при температуре -18°С и хранят в морозильной камере в полиэтиленовой упаковке в течение года.

Отбор проб семян подсолнечника и рапса производится в соответствии с ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб". Семена хранят при комнатной температуре в полотняных мешочках, перед анализом доводят до стандартной влажности и измельчают. Растительное масло хранят в холодильнике при температуре 0 - 4°С в герметично закрытой стеклянной таре в течение 6 месяцев.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители при необходимости перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2%-м раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют. Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 ацетона 10 г и 2 г ). Ацетонитрил сушат над пентоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием. Диэтиловый эфир перед употреблением высушивают над едким кали.

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа аналитические колонки кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1-0,2 мл/мин) до стабилизации нулевой линии в течение 1 ч.

2.5.3. Приготовление растворов

Для приготовления 0,005 М раствора ортофосфорной кислоты 0,5 г 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 , растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

2.5.3.1. Приготовление стандартного и градуировочных растворов.

Точную навеску Пропизахлора (50 мг) помещают в мерную колбу объемом 100 , растворяют в ацетонитриле и доводят до метки (стандартный раствор с концентрацией 0,5 ). Градуировочные растворы с концентрациями 2,5, 5,0, 10,0, 20,0 и 25,0 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя подвижную фазу.

Стандартный раствор можно хранить в холодильнике в силанизированном или тефлоновом флаконе при температуре 0 - 4°С в течение 1 месяца, градуировочные растворы используют в течение рабочего дня.

При изучении полноты извлечения Пропизахлора используют ацетонитрильные растворы вещества.

2.5.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация Пропизахлора в растворе) в хроматограф вводят по 10 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации Пропизахлора в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:

С = KS, где

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

,

где

С - аттестованное значение массовой концентрации Пропизахлора в градуировочном растворе;

- результат контрольного измерения массовой концентрации Пропизахлора в градуировочном раствор;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % (=10% при P = 0,95).

2.5.5. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

2.5.6. Подготовка концентрирующих патронов для очистки экстракта

2.5.6.1. Кондиционирование патронов, заполненных гексадецилсиликагелем, - Диапак С16 (0,4 г), осуществляют, пропуская через патрон последовательно по 1 ацетонитрила и воды. Элюат отбрасывают.

2.5.6.2. Кондиционирование патронов, заполненных силикагелем 60 (0,5 г), осуществляют пропусканием 2,5 гексана.

2.6. Проведение определения

2.6.1. Определение Пропизахлора в пробах воды

Аликвоту предварительно отфильтрованной воды (50 ) пропускают через откондиционированный патрон Диапак С16 (0,4 г). Фильтрат отбрасывают. Пропизахлор элюируют 5 ацетонитрила. Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40°С. Сухой остаток растворяют в 0,4 подвижной фазы. 10 вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.2. Определение Пропизахлора в пробах почвы

Образец просеянной через сито почвы массой 10 г помещают в коническую колбу вместимостью 100 с притертой пробкой, прибавляют 5 воды и 35 ацетона и экстрагируют в УЗ-бане в течение 15 мин. Суспензию фильтруют в вакууме через воронку Бюхнера (фильтр "красная лента"), осадок на фильтре промывают 5 ацетона. Экстракцию повторяют и объединенные фильтраты упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С до полного удаления ацетона. Водный остаток пропускают через два соединенных последовательно и откондиционированных патрона Диапак С16, промывают двумя порциями воды по 2 . Фильтрат и промывки отбрасывают. Пропизахлор элюируют 4 ацетонитрила. Элюат упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 1 подвижной фазы и 10 полученного раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.3. Определение Пропизахлора в зерне кукурузы, семенах подсолнечника и рапса, зеленой массе рапса и кукурузы

Навеску размолотых на лабораторной мельнице семян или измельченной зеленой массы (20 г) помещают в коническую колбу вместимостью 250 , прибавляют 50 80% водного ацетона* и экстрагируют в УЗ-бане в течение 15 мин при температуре 30°С. Экстракцию повторяют еще два раза. Экстракт упаривают на ротационном испарителе до полного удаления ацетона при температуре водяной бани 40°С. Водный остаток фильтруют через бумажный фильтр и пропускают через два соединенных последовательно и откондиционированных патрона Диапак С16. Фильтрат и промывки отбрасывают. Пропизахлор элюируют 4 ацетонитрила. Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 40°С. Сухой остаток растворяют в 1 гексана и количественно вносят в откондиционированный патрон с силикагелем 60. Патрон промывают дважды 2,5 гексана. Фильтрат и промывки отбрасывают. Пропизахлор элюируют 3 смеси гексан-эфир в соотношении 7:3. Элюат упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 2 подвижной фазы и 10 образца вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.4. Определение Пропизахлора в растительном масле

К 5 г масла прибавляют 40 ацетонитрила и экстрагируют в УЗ-бане в течение 15 мин при 30°С. Экстракцию повторяют с двумя свежими порциями ацетонитрила по 40 . Объединенный экстракт центрифугируют в течение 10 мин при скорости 8 000 об/мин. Супернатант промывают тремя порциями гексана по 20 . Гексановые промывки отбрасывают. Ацетонитрильный раствор упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 40°С. Сухой остаток растворяют в 1 гексана и далее пробу чистят на патроне с силикагелем 60 так, как это описано в п. 2.6.1. После очистки сухой остаток растворяют в 1 подвижной фазы и 10 образца вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.5. Условия храматографирования

Ультраэффективный жидкостной хроматограф "ACQUITY" фирмы "Waters" с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Для анализа проб масла, зеленой массы и семян подсолнечника используют колонку 1. Пробы рапса и зерна кукурузы анализируют на колонке 2. Температура колонки (301)°С. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 53:47 (колонка 1) и 60:40 (колонка 2). Скорость потока элюента 0,2 . Рабочая длина волны УФ-детектора 220 нм. Объем вводимой пробы 10 . Время удерживания Пропизахлора на колонках 1 и 2 составляет 5,10,2 мин.

3. Обработка результатов анализа

Содержание Пропизахлора в воде, почве, зерне кукурузы, семенах подсолнечника и рапса, зеленой массе, растительном масле (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

, где

- площадь пика Пропизахлора в стандартном растворе (мВ. сек);

- площадь пика Пропизахлора в анализируемой пробе (мВ. сек);

V - объём пробы, подготовленной для хроматографического анализа, ;

Р - навеска анализируемого образца, г;

С - концентрация стандартного раствора Пропизахлора, .

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор Пропизахлора 1 , разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

4. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает придела повторяемости (1):

, где

(1)

, - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

5. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

мг/кг при вероятности Р = 0,95, где

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

, где

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее нижней границы определения" (например: менее 0,025 мг/кг*, где * - 0,025 мг/кг - предел обнаружения Пропизахлора в почве).

6. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

6.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

6.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

, где

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг; при этом:

, где

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

, где

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

, где

, X, - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 4) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

,

(2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

6.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

, где

(3)

, - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

7. Требования безопасности

7.1. При проведении работы необходимо соблюдать требования техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007). Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

7.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны".

8. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 6.

9. Разработчики

Долженко В.И., Цибульская И.А., Журкович И.К., Луговкина Н.В., Ковров Н.Г.

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, г. Санкт-Петербург.

Методика прошла метрологическую экспертизу (Свидетельство об аттестации N 01.5.04.693 от 23.11.2010).

_____________________________

* При определении Пропизахлора в зеленой массе прибавляют 50 ацетона, не содержащего воды.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко