Приложение 2. Методы санитарно-паразитологической экспертизы рыбы

Приложение 2

Методы санитарно-паразитологической экспертизы рыбы

Исследование рыбы на наличие метацеркарий описторхисов проводится в соответствии с МУК 3.2.988-00 "Методы санитарно-паразитологической экспертизы рыбы, моллюсков, ракообразных, земноводных, пресмыкающихся и продуктов их переработки" при соблюдении режимов работы с инвазионным материалом, регламентированных СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами".

Отбор и объем проб рыбы и продуктов её переработки осуществляется в соответствии с требованиями:

- ГОСТ 7631-85 "Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Правила приемки, органолептические методы оценки качества, методы отбора проб для лабораторных испытаний";

ГАРАНТ:

Приказом Ростехрегулирования от 18 августа 2008 г. N 178-ст взамен ГОСТ 7631-85 в части определения органолептических и физических показателей с 1 января 2009 г. введен в действие ГОСТ 7631-2008

Приказом Ростехрегулирования от 27 декабря 2006 г. N 501-ст взамен ГОСТ 7631-85 в части правил приемки и методов отбора проб с 1 июля 2008 г. введен в действие ГОСТ 31339-2006

- МУ 3.2.1756-03 "Эпиднадзор за паразитарными болезнями".

Объектами исследований являются пресноводные рыбы семейства карповых и продукты их переработки. Метацеркариями описторхиса могут быть заражены: язь, елец, линь, красноперка, плотва, верховка, голавль, лещ, чехонь, синец, гольян (обыкновенный и Чекановского), подуст, белоглазка, уклейка, густера, пескарь, щиповка, жерех, усач, в ряде мест - золотой и серебряный карась.

Для исследования на наличие метацеркарий Opisthorchis felineus целесообразнее отбирать рыб старших возрастов, т.к. личинки паразитов живут несколько лет и их число увеличивается с возрастом рыб.

Сохранять свежевыловленную рыбу до исследования следует в охлажденном состоянии (в холодильнике), не допуская кристаллизации, либо в слегка подвяленном на воздухе виде не более 3-5 дней. Замороженная рыбопродукция (сырье, полуфабрикаты и готовые изделия) до исследования хранится при температуре и в условиях согласно нормативно-технической документации на нее.

Непосредственно перед исследованием мороженую рыбную продукцию размораживают до температуры не ниже 0° в толще тела рыбы. При исследовании вяленой, соленой и копченой рыбы ее предварительно вымачивают в течение суток до размягчения мышц, меняя воду каждые 4-6 ч.

Метацеркарии трематод не видны невооруженным глазом, поэтому выявление личинок производят с использованием оптических средств путем исследования органов и тканей рыб - мест наиболее вероятной их локализации. Личинки описторхисов чаще всего инцистируются в подкожной клетчатке и верхнем слое мышечной ткани (2-4 мм) в области спины рыбы, реже в плавниках, на жабрах, в чешуе. Уточнение видовой принадлежности личинок гельминтов ведется с применением световых микроскопов типа МБС, Биолам или других.

Для исследования мышечной ткани используют компрессорный метод и метод переваривания в искусственном желудочном соке.

Компрессорный метод

Исследуемый участок тела рыбы освобождают от чешуи, затем скальпелем надрезают кожу по средней линии спины и двумя надрезами от первого надреза до боковой линии выделяют участок средней трети спины. Кожу с вычлененного участка поднимают пинцетом и с помощью скальпеля отделяют ее так, чтобы подкожная клетчатка осталась на поверхности мышц. Острым скальпелем соскабливают или срезают тонкие пластинки поверхностного слоя мышц толщиной не более 2-3 мм, размещают их на нижнем стекле компрессория, накрывают другим стеклом и сдавливают их. Наиболее удобно использовать компрессорные стекла, нарезанные из обычного оконного стекла с краями, обработанными наждаком. Размеры стекол 6-8 х 12-15 см, нижнее стекло немного больше верхнего, толщина 3-5 мм. Срезы просматривают с помощью микроскопа типа МБС, используя увеличение в 16-48 раз (окуляр 8х, 12х, объектив 2х, 4х). Для уточнения диагноза кусочки тканей с личинками переносят на предметные стекла, накрывают покровными и исследуют при большем увеличении (например, объектив 8х, 10х, окуляр 7х или 10х, бинокулярная насадка 1,5х) с помощью микроскопа типа Биолам, Бимам.

При обнаружении личинок можно ограничиться просмотром мышц с одной стороны тела. При отсутствии личинок необходимо просмотреть срез и с другой стороны. При исследовании молоди рыб длиной до 20-25 мм их компрессуют целиком. Более крупных сеголеток распластывают на две половинки и просматривают в компрессории со стороны разреза, не снимая кожи и не освобождая от чешуи.

Подсыхающие срезы, препараты увлажняют водой или физиологическим раствором из пипетки.

Метод переваривания в искусственном желудочном соке

Метод основан на том, что в кислой среде метацеркарии освобождаются от наружной оболочки, а окружающая их мышечная ткань переваривается в искусственном желудочном соке.

Приготовление искусственного желудочного сока. На 1 000 мл дистиллированной воды (при ее отсутствии можно использовать кипяченую остывшую до температуры 37-38°С водопроводную воду) добавляют 7 г пепсина, 9,0 г поваренной соли (NaCl) и 10 мл концентрированной соляной кислоты (НСl).

Для выделения метацеркарий трематод берут подкожную мышечную ткань (до 0,5 см). Ее отделяют от кожи, измельчают ножом или в мясорубке. Затем ее заливают в соотношении 1:10 приготовленным искусственным желудочным соком (1 часть фарша и 10 частей искусственного желудочного сока). Пробу помещают в термостат на 3 ч при температуре 36-37°С, после чего содержимое фильтруют в стеклянные цилиндры через металлический фильтр с размером ячеек 1x1 мм или однослойный бинт. Через 15-20 мин верхний слой желудочного сока с переваренной мышечной тканью сливают, а осадок переносят в чашку Петри (или глубокое часовое стекло) и микроскопируют. Для лучшего отделения личинок в чашку Петри наливают физиологический раствор, делают несколько круговых движений, в результате которых метацеркарий концентрируются в центре чашки Петри (часового стекла), а излишки физраствора с остатками мышечной ткани удаляют пипеткой. Процедуру повторяют до полного исчезновения остатков не переваренной мышечной ткани.

Эффективность метода переваривания в сравнении с компрессорным в 1,5 раза выше. Метацеркарий трематод, выделенные этим способом из свежей рыбы, сохраняют свою структуру и жизнеспособность в физрастворе в течение 10-24 ч при температуре 20-25°С и 5-7 дней при температуре 1-4°С и могут быть использованы для биопробы.

Этим методом рекомендуется исследовать такие продукты переработки рыбы, как фарш, жареная, заливная, вяленая рыба.

Большинство метацеркарий трематод, встречающихся в рыбе, не опасно для здоровья человека. Для выявления возбудителей заболеваний человека необходима дифференциальная диагностика. В первую очередь ориентируются на размер и форму обнаруженной цисты, характер ее оболочек; положение личинки в цисте (подвижность*) и ее строение, в т.ч. размер, цвет и форму экскреторного пузыря (рис. 1).

Определение трематод до вида по строению цисты возможно только при достаточном навыке исследователя. В противном случае для уточнения видовой принадлежности трематод целесообразно извлечь метацеркарию из цисты.

Тщательно отделенную от окружающих тканей цисту помещают на стекло в каплю воды или физиологического раствора. Оболочку ее разрывают тонкими иглами (лучше энтомологическими булавками N 00) или легким надавливанием покровного стекла. Если при этом личинка сама не выходит из цисты, то ее вымывают водой из пипетки. Выход метацеркарий из цист можно стимулировать, воздействуя дуоденальным содержимым человека или животных или трипсином.

При обнаружении личинок описторхисов в рыбной продукции, в т.ч. при оценке эффективности ее обеззараживания, необходимо определить их жизнеспособность, т.к. потенциальную опасность для здоровья человека представляют только живые личинки гельминтов.

В первую очередь можно ориентироваться на морфологические признаки и двигательную активность. Метацеркарий описторхисов, выделенных из тканей рыбы с помощью препаровальной иглы, помещают в каплю теплой воды или физиологического раствора (37-40°С) на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и исследуют под малым и большим увеличением микроскопа. Явное нарушение целостности оболочек цист, грубые изменения внутреннего строения личинки, распад ее содержимого, разрушение экскреторного пузыря являются признаками гибели метацеркарий. Наличие даже самых слабых самостоятельных движений личинки свидетельствует о ее жизнеспособности. Отсутствие движения еще не свидетельствует о гибели. Движение можно стимулировать слабым придавливанием метацеркарий покровным стеклом.

Далее можно воспользоваться методом химического воздействия (с использованием химических раздражителей). Вызвать движение личинок можно, воздействуя дуоденальным содержимым, полученным при зондировании человека, либо желчью животных, либо трипсином (0,5% раствор, приготовленный на физрастворе: 0,5 г трипсина растворяют в 100 мл физраствора). На выделенных метацеркарий наносят несколько капель химического реагента так, чтобы полностью покрыть личинок. Для ускорения эксцистирования предметное (часовое) стекло с личинками можно слегка подогреть над пламенем спиртовки, или внести предварительно подогретый до 37-40°С трипсин (или желчь), либо поставить в термостат с t = 37°С на 10 мин. Через несколько секунд под воздействием химического раздражителя начинается выход личинок из цист и их активное движение, что служит показателем жизнеспособности. Процесс эксцистирования личинок контролируют под микроскопом типа МБС. Отсутствие в течение 30 мин всякой двигательной реакции свидетельствует о гибели личинок. Для определения жизнеспособности личинок гельминтов можно использовать и метод переваривания тканей рыбы в искусственном желудочном соке.

Кроме того, определить жизнеспособность метацеркарий трематод можно окрашиванием 0,3%-м раствором розоловой кислоты (аурина) (0,3 г розоловой кислоты растворяют в 100 мл 70° спирта).

Кусочки мышц с личинками освобождают от жира. На ткань наносят 2 капли розоловой кислоты, а через 2 мин - 0,1 N раствор KОН, равномерно распределяя его по ткани. Избыток жидкости с препарата снимают фильтровальной бумагой. Накрывают покровным стеклом и микроскопируют.

Ткань рыбы окрашивается в розовый цвет, живые личинки совершенно не окрашиваются, а мертвые становятся розовыми.

______________________________

* Характерная для метацеркарий описторхисов подвижность внутри цисты может быть выявлена не только в свежевыловленной рыбе, но и в течение нескольких дней после, подвижность может восстанавливаться и после промораживания рыбной продукции, недостаточного по времени для гибели личинки, при повышении температуры до 37°С.