Приложение. Питательные среды для обнаружения и идентификации патогенных кишечных бактерий и вирусов

Приложение

Питательные среды для обнаружения и идентификации патогенных кишечных бактерий и вирусов

1. Для определения сальмонелл и шигелл

1. Приготовление магниевой среды. Магниевая среда в модификации Московского НИИ гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана.

Готовят 3 раствора: А. пептона отечественного производства - 4,2 г.

хлористого натрия - 7,15 г

- 1,43 г

дрожжевого диализата - 9,0 мл.

воды дистиллированной - 890,0 мл.

Б. Хлористого магния кристаллического - 35,7 г.

воды дистиллированной - 90,0 мл.

В. 0,5% водного раствора бриллиантового зеленого - 0,9 мл

Смешивают, стерилизуют при 0,5 атм. 30 минут.

При посевах больших количеств исследуемого материала концентрацию всех ингредиентов, кроме дистиллированной воды, удваивают.

2. Среда с охмеленным суслом. Охмеленное сусло получают на пивоваренных заводах. В стерильной посуде охмеленное сусло, отобранное с соблюдением правил асептики, можно сохранять при температуре холодильника (+4°) в течение 3-4 недель.

Приготовление среды (ex Temporae)

I. 1. Охмеленное сусло - 100 мл

2. Пептон (отечественный) - 5 г

3. 20% р-р NaOH - 12 капель

После перемешивания прокипятить на медленном огне в течение 10 минут. Остудить.

II. 0,1% водный раствор бриллиантгрюна

Посев воды

В 0,5 л стерильную стеклянную посуду (мерные флаконы из-под питательных сред, используемых вирусологами) налить остуженное охмеленное сусло 100 мл, добавить 400 мл испытуемой воды. После этого добавить 7 - 9 мл 1% водного раствора бриллиантгрюна в зависимости от степени загрязнения исследуемой воды (для речной воды - 7 мл, для сточной - 9 мл). После тщательного перемешивания посев поставить в термостат для подращивания в течение 20 - 24 часов при температуре 37°.

III. Среда Левина с антибиотиком. На 1 л свежеприготовленной среды Левина (до застывания) добавляют 8 мл 0,5% раствора синтомицина или 4 мл 0,5%, раствора левомицетина. После этого среду разливают на чашки.

2. Для выращивания холерных вибрионов

1. Пептонная вода. Основной раствор пептона готовят по следующей прописи:

Пептон	-	100 г
Хлористый натрий	-	50 г
Азотнокислый калий	-	1 г
Углекислый натрий	-	25 г
Дистиллированная вода	-	1000 мл
рН - 9,0

Смесь пептона с хлористым и углекислым натрием растирают в ступке, после чего растворяют в дистиллированной воде при кипячении; затем прибавляют азотнокислый калий. Раствор автоклавируют при 120° в течение 20 мин. (фильтрацию проводят до стерилизации). Основной раствор пептона (10% пептонная вода) сохраняется длительное время (до 6 месяцев).

Для получения 1% пептонной воды основной раствор пептона разводят в 10 раз, т.е. 1 объем основного раствора на 9 объемов дистиллированной воды. Полученную пептонную воду разливают в соответствующую посуду и стерилизуют, доведя предварительно рН до 8,8 - 9,0. Срок хранения 2 месяца.

2. Пептонная вода с теллуритом калия. В 1% пептонную воду после автоклавирования добавляют теллурит калия (калий теллуристокислый в конечном разведении 1:100 000 или 1:200 000). Среда готовится непосредственно перед употреблением или не ранее, чем за сутки. Концентрацию теллурита калия желательно предварительно оттитровать на культуре холерного или нехолерного вибриона.

Примечание: Теллурит калия 2% раствор во флаконах по 5 мл выпускает Мосхимфармзавод им. Семашко.

Плотные среды

3. Щелочной агар (рН 7,8 - 8,0). К 1 литру нейтрального мясопептонного 2% агара или агара, приготовленного на переваре Хоттингера, прибавляют 30 мл 10% раствора углекислого натрия, кипятят 45 минут, фильтруют, разливают и стерилизуют в автоклаве 20 минут при 120°. Агар должен быть прозрачным. Срок хранения 3 месяца в прохладном месте.

4. Щелочная, таурохолатовая, теллуритовая, желатиноновая, агаровая среда (среда Монсура оригинальная).

Триптиказа	-	10,0
Хлористый натрий	-	10,0
Таурохолат натрия	-	5,0
Карбинат натрия	-	1,0
Желатина Дифко	-	30,0
Агар-агар	-	15,0к
Дистиллированная вода	-	до 1000 мл

Полностью растворить хлорид натрия и агар, затем желатину и другие ингредиенты в кипящей водяной бане при частом встряхивании. Довести рН до 8,5, разлить по 20 мл в колбы с притертыми пробками, стерилизовать при 1,5 атм. 15 минут. Среду хранить в прохладном месте. Перед разливом ее в чашки добавить теллурит калия в концентрации 1:200 000, чашки со средой можно использовать в течение 5 дней.

5. Среда Монсура в модификации Т.Н. Донской и Л.Ф. Зыкина

Агар Хоттингера 1,5%	-	1000,0
Желатина	-	50,0
Бычья желчь	-	50,0

рН устанавливают 7,4 - 7,6. Стерилизуют текучим паром или при 110° 15 минут. Перед разливкой добавляют теллурит калия в концентрации 1 :100 000.

6. Бакто-агара ТСВ - сухая среда для диагностики холеры (рН 8,6) выпускается фирмой Дифко-Детроиз, штат Мичиган, США. Состав на 1 литр дистиллированной воды:

Дрожжевый экстракт	-	5 г
Пептон	-	10 г
Цитрат натрия	-	10 г
Тиосульфат натрия	-	10 г
Бычья желчь	-	8 г
Сахароза	-	20 г
Хлористый натрий	-	10 г
Цитрат железа	-	1 г
Бромтимоловый синий	-	0,04
Тимоловый синий	-	0,04
Агар-агар	-	15

На 1 литр дистиллированной воды берут 89 г сухой среды, нагревают до кипения (до полного растворения). Среду, не стерилизуя, разливают в чашки Петри.

7. Желчно-солевой агар. К мясо-пептонному агару (рН 8,0) добавляют 0,5 поваренной соли и 0,5% таурохолата натрия. Для подавления роста протея концентрацию таурохолата натрия можно повышать до 1%, стерилизуют при 110° 15 минут.

8. Агар Дьедонне. Приготовляется смесь равных объемов стерильно собранной дефибринированной крови барана, быка или лошади и нормального раствора едкого калия. Стерилизуют при 100° в течение получаса. 3 части этой смеси щелочного альбумината тщательно смешивают с 7 частями расплавленного и охлажденного до 45° мясопептонного 3% агара нейтральной реакции и разливают в чашки Петри. Ввиду того, что свежеприготовленная среда содержит аммиак, вредно действующий на рост холерных вибрионов, перед употреблением ее нужно выдерживать при 37° в течение 24 часов.

9. Среда Аронсона типа Эндо. Содержит сбраживаемый углевод и обесцвеченный фуксин. Окраска фуксина восстанавливается в присутствии промежуточных альдегидов, образующихся в процессе ферментации сахарозы.

Способ приготовления: мясо-пептонный 3% агар проваривают в течение 4 - 5 часов в аппарате Коха. К 100 мл горячей воды добавляют 5-6 мл 100% раствора безводной углекислой соды и стерилизуют 10 - 15 мин при 100°, после чего к 100 мл горячей среды добавляют 5 мл 20% раствора сахарозы и 5 мл 20% раствора декстрина, предварительно простерилизованных в автоклаве или фильтрацией, 0,4 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина и 2 мл свежеприготовленного раствора сульфита натрия, предварительно простерилизованного кипячением. Готовую среду, остуженную до 45 - 50°, разливают по чашкам. Через 10 - 15 часов роста колонии холерного вибриона на этой среде имеют ярко-красный центр и бледно-розовую или бесцветную периферию.

Среду Аронсона можно приготовить упрощенным методом. Для этого к 100 мл расправленного охлажденного 2% агара Хоттингера (рН 7,8 - 8,0), аминного азота 150 мг% добавляют 1,5 г сахарозы, 0,05 мг - 0,06 мг витамина желательно от 0,3 мл до 0,5 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина и 100 мл водного раствора сернокислого натрия (сульфита натрия) до обесцвечивания (около 3 - 5 мл). Охлаждают до 45 - 50°, разливают в чашки и подсушивают.

10. Лактозо-сахарозная (полууглеводная) среда. Среду готовят по следующей прописи:

Пептона	-	0,5 г
Поваренной соли	-	0,5 г
Лактозы	-	1,0 г
Сахарозы	-	0,1 г
Агар-агара	-	1,0 г
Индикатора Андреде	-	4 мл
Воды дистиллированной	-	100 мл
рН - 7,4

Готовая среда после стерилизации окрашивается как среда Ресселя и посев на нее производится по общепринятой методике.

Холерные и холероподобные вибрионы расщепляют сахарозу, дают покраснение среды в столбике без образования газа. Дизентерийные, тифо-паратифозные бактерии, а также faecalis alcaligenes не изменяют цвет среды. Кишечная палочка образует кислоту с газом как в столбике, так и в скошенном участке среды.

Для определения возбудителей туляремии

Среда Мак-Коя. Стерильно смешивают желток свежих куриных яиц с физиологическим раствором в пропорции 3:2; смесь разливают в стерильные пробирки (по 4-5 мл в каждую) и в скошенном положении выдерживают в течение часа при 80°. Готовую среду ставят на сутки в термостат при 37° для проверки ее стерильности, затем сохраняют на холоде для предотвращения высыхания.

Дифференциально-диагностические среды и реактивы для определения энтеропатогенных кишечных палочек

1. Агар Эндо и агар Плоскирева готовят на выпускаемых в СССР сухих средах Эндо и Плоскирева в соответствии с наставлением, прилагаемым к препаратам.

2. Трехсахарный агар (для определения продуцирования сероводорода)

мясная вода	-	1000 мл
дрожжевой экстракт	-	3,0 г
пептон (семипалатинский)	-	20,6 г
хлористый натрий	-	3,5 г
лактоза	-	10,0 г
сахароза	-	10,0 г
агар-агар (корсаковский, японский или Дифко)	-	15,0 г

Устанавливают рН = 7,1 при помощи 20% раствора гидрата окиси натрия, фильтруют, стерилизуют в автоклаве 30 мин. при 1 атмосфере. Затем добавляют:

	-	0,2 г
гипосульфит натрия	-	0,3 г
глюкозу	-	1,0 г
0,2% водный раствор фенолрот	-	12 мл

Среду разливают в стерильные бактериологические пробирки по 7 мл и стерилизуют текучим паром 20 мин.

При выращивании бактерий, продуцирующих сероводород, на дне пробирки появляется черное окрашивание.

3. Агар Клиглера

Мясная вода	-	1000 мл
протеозопептон	-	20,0 г
хлористый натрий	-	5,0 г
	-	0,4 г
	-	0,08 г
Агар-агар	-	20,0 г

Кипятят, устанавливают рН = 7,8, снова кипятят, фильтруют и добавляют следующие реактивы:

лактоза	-	10,0 г
глюкоза	-	1,0 г
(растворить предварительно в небольшом количестве воды)	-	0,5 г
фенолрот (0,2% раствор в 50% этиловом спирте)	-	12 мл

Разливают в бактериологические пробирки и стерилизуют в автоклаве 20 мин.

При выращивании бактерий, образующих сероводород, на дне пробирки появляется черное окрашивание.

4. Среда с мочевиной (по Преусу)

Стерильный 1,7% агар на мартеновском бульоне	-	1000 мл
Глюкоза	-	5,0 г
50% раствор мочевины	-	20 мл
0,2% раствор бромтимолблау	-	12 мл

Среду разливают в стерильные бактериологические пробирки по 5 - 7 мл и стерилизуют текучим паром 15 мин.

При выращивании бактерий, расщепляющих мочевину, появляется синее окрашивание (положительный результат). При отрицательном результате - окрашивание желтое.

5. Среда Симмонса

Вода дистиллированная	-	1000 мл
	-	1,5 г
	-	1,0 г
	-	0,2 г
Натрии лимоннокислый	-	3,0 г
Агар-агар (корсаковский, японский, Дифко)	-	20,0 г

Устанавливают рН = 7,2 при помощи 10% раствора гидрата окиси натрия, добавляют 10 мл 0,2% раствора бромтимолблау, разливают в стерильные бактериологические пробирки по 7 мл и стерилизуют в автоклаве при 112° 15 мин.

Утилизирующие цитрат натрия бактерии дают на среде хороший рост и изменяют ее окраску в синий цвет (положительный результат). При отрицательном результате окраска среды не изменяется и отсутствует заметный рост бактерии.

6. Индикаторная бумажка на индол.

Пара-диметиламинобензоальдегид	-	5,0 г
Спирт 96°	-	50,0 мл
Фосфорная кислота (очищенная, концентрированная	-	10,0 г

Растирают в фарфоровой ступке. Полученным раствором смачивают край (1-2 см) ленты фильтровальной бумаги, высушивают и нарезают тонкими полосками. Бумажку с реактивом вставляют в пробирку, прижимая пробкой.

В присутствии индола желтоватый цвет пропитанного реактивом участка бумаги меняется на розовый (до малинового) .

Метод определения цитопатического действия в культуре ткани

В качестве объекта заражения могут быть использованы клетки перевиваемых линий и первично-трипсинизированные клетки. Для заражения используют 3-х суточную однослойную культуру в пробирках. Заражение производится из расчета 1 млрд бактериальных клеток изучаемой культуры на 1 мл питательной среды, в которой происходит культивирование клеток ткани. Рекомендуется заражать одним и тем же штаммом не менее 3-х пробирок для получения достоверных данных. Контролем служит незараженная ткань, а также пробирки с тканью, зараженной вульгарной непатогенной кишечной палочкой в той же концентрации (1 млрд на 1 мл питательной среды). Зараженный монослой инкубируют при 37°С в течение 18 - 20 часов, результат просматривают с помощью микроскопа с малым увеличением. В положительных случаях наблюдается полное или частичное разрушение монослоя. В контрольных пробирках должна быть неизменная ткань клеток.

Предварительными исследованиями установлено, что вирулентные культуры патогенных бактерий сохраняют способность вызывать цитопатическое действие в культуре ткани.

Для обнаружения палочек сибирской язвы

Обработка мембранных фильтров

Новые мембранные фильтры в течение суток промывают в проточной водопроводной воде, затем высушивают на фильтровальной бумаге, раскладывая по 1 штуке. Мембранные фильтры перед посевом стерилизуют кипячением в трижды сменяемой дистиллированной воде по 20-30 минут. Необходимо фильтры для кипячения опускать в предварительно нагретую воду во избежание скручивания мембранных фильтров. В последней воде мембранные фильтры хранят до следующего употребления.

Среда ГКИ (Государственного Контрольного Института)

Среда состоит из раствора Хенкса, используемого для поддержания культуры тканей, с добавлением 40% стерильной бычьей сыворотки, предварительно инактивированной при 56° в течение 30 минут. Если не имеется жидкости Хенкса, можно пользоваться бульоном, изготовленном на переваре Хоттингера, к которому добавляют стерильно 40% инактивированной бычьей сыворотки. Среду доводят с помощью двууглекислой среды до рН = 7,2 - 7,4. Пробирки закрывают стерильными резиновыми пробками.

К санитарно-вирусологическим исследованиям

1. Приготовление 0,5 М фосфатного буфера

Раствор N 1 - 0,5 М - 89,0 гр на 1 л. Для получения двухзамещенного фосфорнокислого натрия, содержащего две молекулы кристаллизационной воды, соль предварительно растирают в ступке и высушивают на воздухе 2-3 суток до постоянного веса.

Раствор N 2 - 0,5 М - калий фосфорнокислый однозамещенный - 68,06 гр на 1 л.

Для получения фосфатного буфера с рН = 8,2 берут 96,5 мл раствора N 1 и 3,5 мл раствора N 2. С целью стерилизации приготовленный буфер фильтруют через мембранный (N 2) или асбестовый фильтр.

2. Приготовление лантановых фильтров

а) Водные растворы (0,05% и 1%) технического альгината натрия (полученного с Архангельского водорослевого комбината) приготавливают энергичным встряхиванием и продолжительным набуханием (24 часа) его в воде. Полученную гелеобразную жидкость желтого цвета очищают от примесей фильтрованием через вату и хранят при температуре +4° не более месяца.

б) Водные растворы электролитов

0,5 М р-р Na х. ч. - (216,5 г на 1 л воды)

0,5 М р-р Аl х. ч. кристаллический (120,8 г

на 1 л воды)

в) 3,8% нейтральный водный раствор лимоннокислого натрия

Трехзамещенный лимоннокислый натрий растворяют в воде на водяной бане. Все растворы готовят на стерильной дистиллированной воде.