Приложение B (обязательное). Состав и приготовление питательных сред и реактивов

Приложение B
(обязательное)

Состав
и приготовление питательных сред и реактивов

B.1 Бульон Болтона

B.1.1 Базовая среда

B.1.1.1 Состав:

продукт ферментативного переваривания животных тканей - 10,0 г;

гидролизат лактальбумина - 5,0 г;

дрожжевой экстракт - 5,0 г;

натрия хлорид - 5,0 г;

натрия пируват - 0,5 г;

натрия пиросульфит - 0,5 г;

натрия карбонат - 0,6 г;

-кетоглутаровая кислота - 1,0 г;

гемин (раствор в 0,1%-ном растворе натрия гидроксида) - 0,01 г;

вода - 1000 .

B.1.1.2 Приготовление

Базовые компоненты по B.1.1.1 или готовую сухую среду растворяют в 1000  воды при слабом нагреве.

Корректируют pH так, чтобы после стерилизации его значение для готовой среды составляло (7,40,2) ед. pH при температуре 25°С.

Среду разливают в колбы вместимостью 100 - 200 . Стерилизуют в автоклаве (6.1) при температуре 121°С в течение 15 мин.

B.1.2 Стерильная лизированная дефибринированная кровь лошади

Используют кровь лошади, лизированную сапонином или замораживанием и последующим размораживанием.

B.1.3 Раствор антибиотиков

B.1.3.1 Состав:

цефоперазон - 0,02 г;

ванкомицин - 0,02 г;

триметоприма лактат - 0,02 г;

амфотерицин B - 0,01 г;

этанол/стерильная дистиллированная вода 50/50 (по объему) - 5,0 см.

B.1.3.2 Приготовление

Компоненты растворяют в смеси этанола и стерильной дистиллированной воды в соотношении 50:50.

B.1.4 Полная среда

B.1.4.1 Состав:

базовая среда (B.1.1) - 1000 ;

стерильная лизированная дефибринированная кровь лошади (B.1.2) - 50 ;

раствор антибиотиков (B.1.3) - 5 .

B.1.4.2 Приготовление

К базовой среде при температуре от 47°С до 50°С в стерильных условиях добавляют кровь, затем раствор антибиотиков и перемешивают. Соблюдая стерильность, среду разливают в пробирки или колбы, чтобы приготовить объем сред, необходимый для испытания. Если обогатительную среду приготавливают заранее, ее надо хранить не более 4 ч при комнатной температуре или в темном месте при температуре (32)°С не более семи дней.

B.1.5 Эксплуатационное испытание

Эксплуатационные характеристики бульона Болтона необходимо испытывать в соответствии с методами и критериями, описанными в ИСО 11133-2. Примерами подходящих контрольных штаммов являются Campylobacter jejuni NCTC 11351 или ATCC* 33291 со следующими критериями: > 10 колоний на модифицированном агаре с углем, цефоперазоном и дезоксихолатом (mCCD) после инкубации в аэробных условиях при температуре 41,5°С в течение (444) ч.

B.2 Модифицированный агар с углем, цефоперазоном и дезоксихолатом (агар mCCD)

B.2.1 Базовая среда

B.2.1.1 Состав:

мясной экстракт - 10,0 г;

продукт ферментативного переваривания животных тканей - 10,0 г;

натрия хлорид - 5,0 г;

древесный уголь - 4,0 г;

продукт ферментативного переваривания казеина - 3,0 г;

дезоксихолат натрия - 1,0 г;

железа сульфат (II) - 0,25 г;

натрия пируват - 0,25 г;

агар - 8,0 - 18,0 г**;

вода - 1000 .

B.2.1.2 Приготовление

Компоненты для базовой среды или сухую базовую среду растворяют в 1000  воды и постепенно доводят до кипения. При необходимости корректируют pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял (7,40,2) ед. pH при температуре 25°С.

Базовую среду разливают в колбы вместимостью 100 - 200 . Стерилизуют в автоклаве (6.1) при температуре 121°С в течение 15 мин.

B.2.2 Раствор антибиотиков

B.2.2.1 Состав:

цефаперазон - 0,032 г;

амфотерицин B - 0,01 г;

вода - 5 .

B.2.2.2 Приготовление

Компоненты растворяют в воде. Стерилизуют фильтрацией.

B.2.3 Полная среда

B.2.3.1 Состав

базовая среда (B.2.1) - 1000 ;

раствор антибиотиков (B.2.2) - 5 .

B.2.3.2 Приготовление

Раствор антибиотиков добавляют к базовой среде, охлажденной до температуры 47°C - 50°C, затем тщательно перемешивают. Разливают по 15  полной среды по стерильным чашкам Петри. Дают затвердеть. Непосредственно перед применением тщательно высушивают слои агара, предпочтительно с открытыми крышками и поверхностью агара, направленной вниз в сушильном шкафу (6.2), в течение 30 мин или до того момента, когда поверхность агара не будет содержать видимой влаги. Если они были приготовлены заранее, невысушенные агаровые слои следует хранить не более 4 ч при температуре окружающей среды или в темноте при температуре (32)°С не более семи дней.

B.2.4 Эксплуатационное испытание

Определение селективности или производительности - по ИСО 11133-1. Информация об эксплуатационных критериях - в ИСО 11133-2, таблица B.5.

B.3 Колумбийский кровяной агар

B.3.1 Базовая среда

B.3.1.1 Состав:

продукт ферментативного переваривания животных тканей - 23,0 г;

крахмал - 1,0 г;

натрия хлорид - 5,0 г;

агар - 8,0 - 18,0 г**;

вода - 1000 .

B.3.1.2 Приготовление

Базовые компоненты или полную сухую базовую среду растворяют в воде нагреванием. При необходимости корректируют pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял (7,30,2) ед. pH при температуре 25°С Базовую среду распределяют в колбы подходящей вместимости. Стерилизуют в автоклаве (6.1), установленном на температуре 121°С, в течение 15 мин.

B.3.2 Стерильная дефибринированная баранья кровь

B.3.3 Полная среда

B.3.3.1 Состав:

базовая среда (B.3.1) - 1000,0 ;

раствор антибиотиков (B.2.2) - 5,0 .

B.3.3.2 Приготовление

Кровь в стерильных условиях добавляют к базовой среде, охлажденной до температуры 47°- 50°C, затем перемешивают. Разливают около 15  полной среды по стерильным чашкам Петри. Дают затвердеть. Непосредственно перед применением тщательно высушивают слои агара, предпочтительно с открытыми крышками и поверхностью агара, направленной вниз в сушильном шкафу (6.2), в течение 30 мин или до того момента, когда поверхность агара не будет содержать видимой влаги. Если они были приготовлены заранее, невысушенные агаровые слои следует хранить не более 4 ч при температуре окружающей среды или не более семи дней при температуре (32)°С.

B.4 Бульон Бруцелла

B.4.1 Состав:

продукт ферментативного переваривания казеина - 10,0 г;

продукт ферментативного переваривания животных тканей - 10,0 г;

глюкоза - 1,0 г;

дрожжевой экстракт - 2,0 г;

натрия хлорид 0- 5,0 г;

натрия гидросульфит - 0,1 г;

вода - 1000  .

B.4.2 Приготовление

Компоненты для базовой среды или готовую сухую среду растворяют в воде, постепенно нагревая. При необходимости корректируют pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял (7,30,2) ед. pH при темпера туре 25°С. Базовую среду объемом 10  распределяют в колбы подходящей емкости. Стерилизуют в автоклаве (6.1) при температуре 121°С в течение 15 мин.

B.5 Реагент для обнаружения оксидазы

B.5.1 Состав:

N,N,N',N'-тетраметил-1,4-фенилендиамина дигидрохлорид - 1,0 г;

вода - 100,0 .

B.5.2 Приготовление

Компоненты растворяют в воде непосредственно перед использованием.

B.6 Реагенты для обнаружения гидролиза гиппурата

B.6.1 Раствор гиппурата натрия

B.6.1.1 Состав:

натрия гиппурат - 10,0 г;

фосфатно-буферный солевой раствор (PBS):

натрия хлорид - 8,5 г;

динатрия гидрофосфат дигидрат () - 8,98 г;

натрия дигидрофосфат моногидрат () - 2,71 г;

вода - 1000,0 .

B.6.1.2 Приготовление

Гиппурат натрия растворяют в растворе PBS. Стерилизуют путем фильтрации. Соблюдая стерильность, реагент объемом 0,4  распределяют в малые колбы подходящей вместимостью (6.7). Хранят при температуре 20°С.

B.6.2 Раствор нингидрина, 3,5% (масса/объем)

B.6.2.1 Состав:

нингидрин - 1,75 г;

ацетон - 25 ;

бутанол - 25 .

B.6.2.2 Приготовление

Нингидрин растворяют в смеси ацетон/бутанол. Раствор хранят в холодильнике в темноте не более одной недели.

B.7 Кровяной агар Мюллера-Хинтона

B.7.1 Базовая среда

B.7.1.1 Состав:

продукт ферментативного переваривания животных тканей - 6,0 г;

продукт ферментативного переваривания казеина - 17,5 г;

крахмал растворимый - 1,5 г;

агар - 8,0 - 18,0 г**;

вода - 1000 .

B.7.1.2 Приготовление

Компоненты для среды или готовую сухую базовую среду растворяют в 1000  воды и постепенно доводят до кипения. При необходимости корректируют pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял (7,30,2) ед. pH при температуре 25°С. Базовую среду разливают в колбы вместимостью 100 - 200 . Стерилизуют в автоклаве (6.1) при температуре 121°С в течение 15 мин.

B.7.2 Стерильная дефибринированная баранья кровь

B.7.3 Полная среда

B.7.3.1 Состав:

базовая среда (B.7.1) - 1000,0 ;

стерильная дефибринированная баранья кровь (B.7.2) - 50,0 .

B.7.3.2 Приготовление

Кровь в стерильных условиях добавляют к базовой среде, охлажденной до температуры 47°C - 50°C, постоянно перемешивая. Разливают около 15  полной среды по стерильным чашкам Петри. Дают затвердеть. Непосредственно перед применением тщательно высушивают слои агара, предпочтительно с открытыми крышками и поверхностью агара, направленной вниз в сушильном шкафу (6.2), в течение 30 мин или до того момента, когда поверхность агара не будет содержать видимой влаги. Если они были приготовлены заранее, невысушенные агаровые слои следует хранить не более 4 ч при температуре окружающей среды или не более семи дней при температуре (32)°С.

B.8 Диски с индоксилацетатом

B.8.1 Состав:

индоксилацетат - 0,1 г;

ацетон - 1,0 .

B.8.2 Приготовление

Индоксилацетат растворяют в ацетоне. Наносят от 25 до 50 мкл данного раствора на чистые бумажные диски (диаметр от 0,6 до 1,2 см). После высушивания при комнатной температуре диски хранят при температуре 4°С в темных пробирках или бутылках в присутствии силикагеля.