Методические указания по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства МУ 3049-84 (утв. заместителем Главного государственного санитарного врача СССР от 29 июня 1984 г.)

1. Автоклав (стерилизатор паровой), ГОСТ 19569-74.

2. Бумага масштабно-координатная марки ПЛН ГОСТ 334-73 (полулогарифмическая сетка для расчета активности растворов антибиотиков).

3. Весы лабораторные равноплечие ВЛР-200 г ТУ 25.06.1131-75.

4. Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания - 0,2 кг по ГОСТу 24104-80.

5. Водяная баня лабораторная (аппарат для инактивирования сыворотки крови МРТУ 42.1091-63).

6. Горелка газовая или спиртовая по ГОСТу 10090-74.

7. Ионометр универсальный (pH-метр) ЭВ-74.

8. Колбы стеклянные конические вместимостью 50, 100, 200, 1000  по ГОСТу 10394-72.

9. Линейка по ГОСТу 17435-72.

10. Матрацы стеклянные лабораторные вместимостью 1000 .

11. Мерные колбы и стаканы стеклянные лабораторные на 50, 100, 500 и 1000 по ГОСТу 23932-79.

12. Микроскоп МБИ или МБР по ГОСТу 8284-78.

13. Микроразмельчитель тканей типа РТ-2, МРТУ 04.1.1505-63 (или фарфоровая ступка с пестиком по ГОСТу 9147-73 и кварцевый песок).

14. Ножницы по ГОСТу 21239-77, скальпель ГОСТ 21240-77, пинцеты по ГОСТу 31241-77.

15. Палочки стеклянные.

16. Петля бактериологическая.

17. Пробочное сверло 9 мм.

18. Пипетки измерительные градуированные вместимостью 1,0, 2,0, 5,0, 10,0  по ГОСТу 20292-74.

19. Пробирки стеклянные химические 16 мм по ГОСТу 23932-79.

20. Пробирки центрифужные емкостью 10 .

21. Стеклянный стандарт мутности для оптической стандартизации бактерийных взвесей.

22. Сушильный шкаф круглый по ТУ 64-1-1411.

23. Термостаты электрические с водяной рубашкой по МРТУ 421878-60.

24. Трафарет для вырезания лунок.

25. Уровень для установления горизонтальной поверхности.

26. Холодильник бытовой по ГОСТу 16317-70.

27. Центрифуга лабораторная стационарная ЦЛС-31М по ГОСТу 51107-71; центрифуга настольная ЦЛН-2, МРТУ 421742-63.

28. Цилиндры мерные на 50, 100, 250, 1000 по ГОСТу 1770-74.

29. Чашки биологические стеклянные тип Петри по ГОСТу 23932-79, а также чашки из полимерных материалов.

30. Штативы для пробирок на 20 - 40 гнезд по ТУ 64-1-2669-78.

1. Агар-агар микроскопический по ГОСТу 17206-71.

2. Мясо-пептонный бульон по ГОСТу 20730-75.

3. Дрожжевой экстракт (экстракт кормовых дрожжей сухой, производство МНИИВС).

4. Мясная вода по ГОСТу 20729-75.

5. Панкреатический гидролизат казеина.

6. Пепоин медицинский.

7. Пептон сухой ферментативный, ГОСТ 13805-76.

8. Бульоны Хоттингера с содержанием аминного азота 33 мг%, 100 мг%, 130 - 140 мг% по ГОСТу 10444.1-75.

1. Глюкоза кристаллическая ХЧ по ГОСТу 975-75.

2. Вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72.

3. Натрия гидрат окиси (натр едкий), ГОСТ 4328-66, 10% р-р.

4. Натрий лимоннокислый, х.ч., ГОСТ 22280-76.

5. Калия фосфат однозамещенный, х.ч., ГОСТ 4198-65.

6. Калия фосфат двухзамещенный, х.ч., ГОСТ 2493-65.

7. Натрия фосфат двухзамещенный, х.ч., ГОСТ 11773-66.

8. Спирт этиловый, ректификованный по ГОСТ 5262-67.

9. Кислота соляная, х.ч., уд. вес 1,18 - 1,19.

10. Натрий хлористый, х.ч. по ГОСТу 4233-77.

11. Стандарты антибиотиков производства ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

6.1. Приготовление спор Bac. cereus ATCC 11778

Культуру высевают в пробирки со скошенным агаром (2% МПА, pH 7,10,1) и выращивают при 29,01,0°C в течение 20,02,0 часов. Эту культуру смывают со скошенного агара 8,02,0 мл стерильной дистиллированной воды. Весь объем образовавшейся суспензии вносят в матрацы с 2001,0 мл 2% МПА и выращивают в течение 7 дней при температуре 30°C. Через 7 суток из культуры готовят мазки, окрашивают по Граму и, если в поле зрения содержится 80 - 90% спор, культуру смывают 50 мл стерильной дистиллированной воды. Взвесь спор прогревают на водяной бане при 65 - 70°C в течение 30,01,0 мин., трижды центрифугируют при 3 тыс. оборотов в минуту в течение 10 мин., каждый раз промывая осадок стерильной дистиллированной водой до получения прозрачной надосадочной жидкости. Промытую взвесь спор прогревают вновь на водяной бане 30,01,0 мин. при 65 - 70°C. Полученную взвесь спор стерильно разливают в пробирки или ампулы, запаивают и хранят при температуре не выше 4°C и используют до тех пор, пока споры образуют хороший газон и четко очерченные края зон.

6.2. Приготовление рабочей концентрации Bac. cereus АТСС 11778

Небольшое количество (0,2 мл) споровой взвеси Bac. cereus вносят в стандартную пробирку с 5 мл стерильного физиологического раствора и хорошо перемешивают. По стандарту мутности на 5 ед. полученную взвесь доводят до концентрации микробных тел в 1 мл. Затем 0,2 мл данной взвеси вносят в 100 мл расплавленной и охлажденной до 60°C питательной среды. В итоге нагрузка тест-культуры в питательной среде составляет спор в 1 мл.

6.3. Выращивание спор Bac. mycoidis 537

Культуру пересевают на скошенный агар (2% МПА, среда N 2, pH 7,90,1) и выращивают при 37°C в течение 202,0 часа. В мазках культуры должны быть обнаружены грамположительные палочки с закругленными концами, располагающиеся отдельно или цепочками. Затем эту культуру со скошенного агара смывают 72,0 мл стерильной дистиллированной воды. Образовавшуюся суспензию вносят в матрацы с 2% агаризированной средой, приготовленной на бульоне Хоттингера с содержанием 33 мг% аминного азота, pH 6,10,1 (среда N 4). Засеянные матрацы выдерживают при 37°C в течение 7 дней, после чего готовят мазки и, если в мазках, окрашенных по Граму, имеется в поле зрения 855,0% спор, культуру смывают стерильной дистиллированной водой.

Полученную взвесь спор прогревают при 65 - 70°C в течение 30 мин., а затем поступают так же, как и при получении спор Bac. cereus АТСС 11778, п. 6.1.

Таблица 1

Тест-культуры, питательные среды, буферные растворы, рабочие концентрации стандартов антибиотиков, применяемые для определения антибиотиков в пищевых продуктах

6.4. Приготовление рабочей концентрации Bac. mycoidis 537

В стандартную пробирку с 5 мл стерильной дистиллированной воды добавляют 0,1 - 0,2 мл взвеси спор Bac. mycoidis 537 и по стандарту мутности на 10 ед. разводят споры до 1 млрд. микробных тел в 1 мл. Взвесь спор вносят в охлажденную до 60°C питательную среду из расчета 20 млн. спор в 1 мл среды, т.е. 2 мл 1 млрд. взвеси в 100 мл среды.

6.5. Выращивание S. lutea АТСС 9341 и приготовление микробной взвеси

Культуру выращивают в течение 202,0 час. в пробирках со средой N 7, после чего ее смывают стерильным физиологическим раствором и хранят при 4°C. Микробную взвесь суточной культуры разводят до 1 млрд. микробных тел так же, как и Bac. mycoidis 537. Готовую взвесь засевают в расплавленную и остывшую до 50°C питательную среду N 7 из расчета 30 млн. микробных тел на 1 мл среды, т.е. 3 мл 1 млрд. взвеси на 100 мл среды.

6.6. Выращивание спор Bac. cubtilis АТСС 6633

Культуру высевают в пробирки со скошенным агаром (2% МПА, pH 6,50,1) и выращивают при 37°C в течение 18 - 20 часов. Затем эту культуру со скошенного агара смывают 72,0 мл стерильной дистиллированной воды и засевают матрацы с 2% агаризированной средой, приготовленной на бульоне Хоттингера с содержанием 33 мг% аминного азота, pH 7,90,1 (среда N 5). Выращивают при 37°C в течение 7 суток, а затем поступают так же, как при получении спор Bac. cereus АТСС 11778.

6.7. Приготовление взвеси спор Bac. cubtilis АТСС 6633

В стандартную пробирку с 5 мл стерильной дистиллированной воды добавляют небольшое количество (0,1 - 0,2 мл) споровой взвеси Bac. cubtilis АТСС 6633 и хорошо перемешивают. По стандарту мутности на 5 ед. полученную взвесь доводят до концентрации спор в 1 мл. Затем 1  мл данной взвеси вносят в 100 мл расплавленной и охлажденной до 60°C1°C питательной среды.

6.8. Выращивание M. flavus АТСС 10240

Культуру выращивают в пробирках со скошенным МПА с pH 6,50,1 (среда N 6). Используется суточная культура тест-микроба, выращенная на скошенном МПА pH 6,50,1 при 37°C в течение 191,0 час. Выращенную культуру смывают физиологическим раствором, разводят до 1 млрд. микробных тел по стандарту мутности на 10 ед. Готовую взвесь засевают в расплавленную и остывшую до 50°C питательную среду из расчета 1 мл 1 млрд. взвеси на 100 мл среды.

7.1. Приготовление рабочей концентрации хлортетрациклина (ХТЦ)

Произвольную навеску хлортетрациклина (5 - 15 мг) растворяют в 0,1 н соляной кислоте в соотношении 1:1 (1 мг антибиотика растворяют в 1 мл кислоты) и получают основной раствор. Далее по схеме N 1 на буфере N 2 готовят контрольное разведение антибиотика. Пример. Стандарт ХТЦ содержит 930 ед./мг. Навеску в 100,0001 мг растворяют в 100,0001 мл 0,1 н HCl. Основной раствор содержит 930 ед./мл. Из основного раствора готовят контрольное разведение, равное 0,05 ед./мл.

Схема N 1

Основной раствор хранится в холодильнике 30 суток.

7.2. Приготовление контрольной концентрации стрептомицина

Навеску стандарта растворяют в фосфатном буфере pH 6,0 (N 4) в соотношении 1:1 (1 мг антибиотика растворяют в 1 мл буфера). Этот раствор является основным и хранится в холодильнике до 30 дн. Из основного раствора на фосфатном буфере pH 7,90,1 (буф. N 6) готовят рабочую концентрацию стрептомицина, равную 2 ед./мл.

Основной раствор хранится в холодильнике 30 суток.

Схема N 2

7.3. Приготовление контрольной концентрации пенициллина

Навеску пенициллина растворяют в фосфатном буфере pH 6,0 (буф. N 4) в соотношении 1:1, т.е. 1 мг антибиотика в 1 мл буфера. Этот раствор является основным и хранится в холодильнике 7 дней. Из него на том буфере готовят контрольную концентрацию пенициллина - 0,05 ед./мл.

Схема N 3

Примерная схема приготовления растворов пенициллина из стандартного активностью 1586 ед./мл

7.4. Приготовление контрольной концентрации гризина

Для приготовления основного раствора берут произвольную навеску стандарта гризина (5 - 15 мг) и растворяют ее в 0,01 н HCl из расчета 1 мг или 1000 ед./мг.

Основной раствор хранится в течение 30 дней. Дальнейшие разведения делают на буфере N 7 (pH 3,2) по схеме N 4.

Схема N 4

7.5. Приготовление контрольной концентрации бацитрацина

Для приготовления основного раствора стандарта бацитрацина берут произвольную навеску стандарта бацитрацина (10 - 20 мг) и растворяют ее в фосфатном буфере pH 6,0 (буфер N 4) до получения концентрации 100 ед./мл.

Основной раствор стандарта бацитрацина можно хранить в течение 30 дней. Из основного раствора готовят (рабочее) контрольное разведение, равное 0,2 ед./мл по схеме N 5.

Схема N 5

9.1. Исследование молока, молочных продуктов, яиц

Пробы молока и жидких молочных продуктов по 10,00,1 мл, творога по 10,00,1 г вносят в колбочки емкостью 50 мл и добавляют 10,00,1 мл буферного раствора соответственно определяемому антибиотику, т.е. при определении тетрациклинов - буфер N 3; для стрептомицина - буфер N 6; пенициллина - буфер N 5 (см. раздел 5. Буферные растворы для экстрагирования антибиотиков). Таким образом, получается разведение 1:2.

Яйца, предназначенные для исследования, предварительно прогревают на водяной бане при 65,05,0°C в течение 100,1 мин. Яйца освобождают от скорлупы, затем отвешивают по 10,00,1 г смешанного содержимого каждого яйца в колбочки и приливают 10,00,1 мл буфера соответственно определяемому антибиотику, т.е. при определении тетрациклинов - буфер N 3, стрептомицина - буфер N 6.

Подготовленные пробы помещают в термостат для экстракции антибиотиков на 90,01 мин. при 37°C0,1°C, периодически встряхивая содержимое колбочек, после чего смесь прогревают на водяной бане при температуре 60,01,0°C в течение 20,00,1 мин.

Пробы переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют при 3000100  об./мин. в течение 10,00,1 мин. Надосадочная жидкость является первым разведением (1:2) и готова для внесения в лунки. Второе разведение (1:4) готовят в химических пробирках: 1,00,1 мл надосадочной жидкости приливают к 1,00,1 мл буфера соответственно определяемому антибиотику (без пепсина).

В подготовленные для исследований на соответствующий антибиотик чашки Петри, в три заранее отмеченные стеклографом лунки, вносят контрольное разведение стандарта, соответствующего определяемому антибиотику, по 0,050,01 мл, а в три другие вносят такое же количество одного из разведений испытуемых растворов. Для каждого антибиотика на одну пробу необходимо 2 - 4 чашки Петри, т.е. на каждое разведение по 1 - 2 чашки.

После внесения в лунки экстрактов и стандарта антибиотика с определяемой концентрацией чашки помещают в термостат на 202 часа при температуре 291,0°C (при определении тетрациклинов и пенициллина) или при 371,0°C (при определении стрептомицина).

На следующий день замеряют зоны задержки роста тест-культуры и производят расчет содержания антибиотиков в исследуемых продуктах (п. 10.1).

9.2. Исследование мяса и мясных продуктов

Навески по 10,00,1 г мышечной ткани, почки, печени, легкого и др. органов, вырезанные из средней части образца, измельчают режущим инструментом с последующим растиранием в ступке с кварцевым песком (предварительно простерилизованным), приливая 20,00,1 мл буфера соответственно определяемому антибиотику, т.е. при определении тетрациклинов - буфер N 3, цинкбацитрацина - N 4, гризина - физиологический раствор (0,85% NaCl). При наличии микроразмельчителя тканей к измельченной ножницами пробе добавляют 20,00,1 мл буфера, тщательно перемешивают, переносят в стакан от микроразмельчителя и гомогенизируют образец при максимальной скорости оборотов в течение 3 мин.

Экстракцию антибиотиков проводят в течение 1,50,5 час.

При исследовании на гризин и цинкбацитрацин гомогенат прогревают на водяной бане при 655°C 30 мин. для инактивации возможных ингибиторных веществ и лучшей десорбции антибиотика.

Центрифугируют пробы при 3000  об./мин. в течение 201 мин.

Затем поступают либо соответственно ходу определения, описанному в предыдущем п. 9.1 (когда надосадочную жидкость, являющуюся разведением 1:3, и приготовленное из нее разведение 1:6 вносят в лунки зараженной тест-микробом среде, далее по тексту п. 9.1), либо следующим образом:

Надосадочную жидкость в количестве 0,050,001 мл от каждого исследуемого образца вносят в 2 - 3 лунки на 2 параллельные чашки Петри. При определении гризина чашки ставят на 3 часа в холодильник при +4°C для преддиффузии.

Засеянные чашки с внесенной в лунки надосадочной жидкостью инкубируют в течение 180,5 час. при 291°C (определение тетрациклинов) либо при 370,1°C (определение гризина и цинкбацитрацина), после чего измеряют диаметры зон задержки роста тест-культуры и производят расчет активности остаточных количеств антибиотиков в исследуемых субстратах (п.п. 10.1, 10.2).

10.1. Форма записи измерения зон задержки роста тест-микробов при расчете активности антибиотиков, содержащихся в виде остаточных количеств в пищевых продуктах, по таблицам Дмитриевой В.С.

(Примерный образец)

В среднее зон стандарта каждой чашки вносят поправку по постоянной зоне таблиц, которая равна 17 мм, что соответствует контрольной концентрации стандарта 0,05 ед./мл, а затем поправку вносят в величину зон испытуемого препарата.

Определяют разность диаметров зон подавления роста при двух разведениях испытуемого препарата:

20,2 - 17,3 = 2,9 мм.

По таблице, соответствующей этой разности диаметров зон, находят значение активностей соответствующих диаметров зон подавления роста после поправки. В вертикальном столбце находят целые числа, в горизонтальном - десятые доли. Полученные значения умножают на соответствующие показатели разведения (2 и 4; 3 и 6).

Пример расчета. Если контрольная концентрация больше или меньше 1 ед./мл, то надо соответственно умножить или разделить на кратность этого числа 1 (К = 0,05 ед./мл, кратность = 20).

6,465 : 20 = 0,323, соответствует 6,465 x 0,05;

К = 2 ед./мл - 6,465 x 2 = 12,93 ед./мл.

10.2. Построение стандартных кривых и расчет концентрации антибиотиков

10.2.4. Расчет активности по стандартной кривой

 

Для экстракта (или его значения) исследуемой пробы рассчитывают среднеарифметическое значение диаметров зон задержки роста тест-микроба двух параллельных чашек и наносят его в виде точки на оси абсцисс полулогарифмической сетки. Из этой точки восстанавливают перпендикуляр и проводят его до пересечения со стандартной кривой. Через точку пересечения перпендикуляра со стандартной, параллельно оси абсцисс, проводят прямую до пересечения с осью ординат. Точка пересечения параллельной прямой с осью ординат указывает на активность антибиотика в экстракте исследуемой пробы - "С". Если исследовалось разведение экстракта, то полученный показатель его активности умножают на показатель разведения экстракта.

Расчет содержания остаточных количеств антибиотиков в 1 г исследованного продукта (в том случае, когда стандартная кривая построена с использованием стандартных растворов, внесенных в гомогенаты мышечной ткани или субпродуктов) ведется по формуле:

 

X = C x 1,5,

 

где: X - активность антибиотика в 1 г продукта;

C - активность антибиотика в 1 мл экстракта исследуемой пробы;

1,5 - степень разведения пробы буфером, отличная от разведения стандартного гомогената.

В случае, когда для построения стандартной кривой использовались чистые растворы стандартного антибиотика, расчет ведут по той же формуле, изменив лишь степень разведения пробы буфером на 3, а именно: X = C x 3. В данном случае в ответе указывают, что стандартная кривая построена с использованием чистых растворов антибиотиков.

 

Полулогарифмическая сетка для расчета активности растворов антибиотиков

 

 

Примерная форма представления результатов определения остаточных количеств антибиотиков в пищевых продуктах (отдельно по видам антибиотиков)

 

Вид исследуемых продуктов	Общее число проб	Положительные результаты
		кол-во проб	в % к общему кол-ву проб	в том числе в ед./мкг/мл/г
				0,01 - 0,05		0,051 - 0,1		0,11 - 1,0		1,1 и более
Мясо
Мясопродукты
Молоко
Творог
Сметана
Яйца
ВСЕГО:

1. Для каждой новой партии питательной среды необходимо проверять зоны контрольного разведения стандартного раствора антибиотика.

2. Для внесения в лунки берется то рабочее (контрольное) разведение антибиотика, которое дает диаметр задержки роста тест-культуры, приблизительно 17 мм (16 - 18 мм).

3. Для внесения в лунки испытуемых разведений одной пробы можно пользоваться одной пипеткой, при этом надо начинать с большего разведения (1:4 или 1:6).

4. Каждая партия стандарта пенициллина и стрептомицина отличается своей активностью и поэтому дается примерная схема приготовления рабочего разведения.

5. Стандарты антибиотиков и стандарты мутности можно выписать по следующим адресам: