Методические указания по обнаружению возбудителей кишечных инфекций бактериальной природы в воде (утв. Министерством здравоохранения СССР 28 мая 1980 г.)

I. Отбор воды, хранение и транспортировка проб

Питьевую воду отбирают в количестве 3 л.

Воду открытых водоемов - в количестве 1 л.

Сточную воду - 100 мл.

Пробы воды для бактериологического анализа отбирают с соблюдением правил стерильности: в стерильные бутылки или стерильными приборами - батометрами.

Для отбора воды из открытых водоемов, сточных вод, воды из бассейнов, колодцев удобен так называемый бутылочный батометр.

При отборе проб сточной жидкости используют металлические черпаки на деревянных или другого металла ручках либо бутыли, укрепленные винтовым зажимом на деревянном или металлическом стержне.

Пробы воды из кранов отбирают после их стерилизации путем фламбирования пламенем горящего тампона, смоченного спиртом, и последующего спуска воды в течение 10-15 минут при полном открытом кране. В случае, если кран оголовка скважины находится в заглубленной части шахты, то воду из него сливать не следует (избегая затопления шахты), а использовать только обжиг крана. Если отбираемая вода содержит следы остаточного хлора, то для нейтрализации хлора необходимо перед отбором во флаконы добавить 1,5% стерильный раствор тиосульфата (гипосульфита натрия) из расчета 4 мл на 1 л воды.

При отборе проб воды из открытых водоемов следует предусмотреть следующие точки: в месте застоя и в месте наиболее быстрого течения (с поверхности и на глубине 50-100 см).

При отборе проб сточной жидкости следует предусмотреть точки на этапах ее очистки; воду из колодцев отбирают с поверхности и на глубине 20-30 см, воду централизованного водоснабжения - из кранов по разводящей сети. При отборе воды из артезианских скважин предусматривают следующие точки: из крана оголовка скважины, из крана на выходе водоразборных сооружений, из крана после подземного резервуара, перед поступлением в сеть, по разводящей сети.

Отбор проб в бассейнах производят при водообмене, в местах водозабора, на этапах очистки и обеззараживания, перед подачей воды в бассейн, на сливе воды из бассейна, в ванне бассейна - с поверхности и на глубине 20-30 см.

Отобранные пробы воды должны сопровождаться документом, содержащим:

1. Наименование пробы воды.

2. Точное наименование места отбора проб воды.

3. Дату и время отбора, а также дату и время доставки пробы воды в лабораторию.

4. Указание температуры отобранной воды.

5. Указание, по чьему заданию и с какой целью производится исследование.

6. Кем произведен отбор пробы воды (фамилия, должность).

Пробы воды доставляют в лабораторию не позднее 5 часов с момента взятия пробы.

II. Методы исследования воды

1. Прямой посев исследуемой воды на диагностические среды для определения шигелл.

1.1. Питьевая вода.

Воду предварительно фильтруют через мембранные фильтры N 3 в объеме не менее 500 мл. Фильтры помещают на поверхность питательных сред: агара с эозин-метиленовым синим (ЭМС) и бактоагара Плоскарева - антибиотиком и без него. Выбор антибиотика зависит от того, к каким антибиотикам устойчивы штаммы шигелл, выделяемые в данном районе. Посевы подращивают 18-24 часа при 37°C.

1.2. Вода открытых водоемов.

Воду предварительно фильтруют через мембранные фильтры N 3 в объеме не менее 500 мл. Дальнейшее исследование проводят так же, как и при анализе питьевой воды.

1.3. Сточная вода.

Исследуемую воду в количестве 0,1 мл помещают на чашки с дифференциально-диагностической средой (не менее 5 чашек) и растирают шпателем. Посевы инкубируют в термостате при 37°C 18-24 часа.

Дальнейшая идентификация бактерий проводится по общепринятой методике.

2. Посев воды в накопительные среды.

Используют не менее двух сред накопления. Для сальмонелл: магниевую среду, среду Кауфмана, селенитовый бульон, среду с охмеленным суслом. Для шигелл: селенитовый бульон, среду с охмеленным суслом, а также 1% мясопептонный бульон и 10% желчный бульон (метод Ростовского-на-Дону НИИЭМГ).

2.1. Посев питьевой воды.

Исследуемую воду фильтруют через мембранный фильтр N 3 (количество фильтров зависит от скорости фильтрации). Фильтры укладывают на поверхность питательной среды Эндо, разлитой в чашки Петри (поверхность фильтра с задержавшимися бактериями остается верхней). Посев подращивают при 37°C 18-24 часа.

После учета выросших на мембранных фильтрах колоний кишечных палочек для определения коли-титра производят следующее: мембранные фильтры, на которых имелся рост мелких единичных бесцветных колоний, помещают в среды накопления - селенитовый бульон или магниевую среду обычной концентрации, разлитые в пробирки по 10 мл, в среду с охмеленным суслом, предварительно разбавленную стерильной водопроводной водой 1:4 и разлитую в пробирки по 10 мл. Посев помещают в термостат на 18-24 часа при 37°C.

При отсутствии мембранных фильтров исследуемую воду распределяют по 500 мл во флаконы и вносят в среды накопления согласно прописям сред. Посевы помещают в термостат на 18-24 часа при 37°C.

2.2. Посев воды открытых водоемов.

Исследуемую воду в количестве 1 л делят на две порции по 500 мл. В каждую порцию вносят накопительные среды по прописям, после чего воду с накопительной средой разливают поровну в 5 флаконов и помещают в термостат на 18-24 часа при 37°C.

2.3. Посев сточной воды.

Сточную воду в количестве 100 мл вносят в накопительные среды по прописям и разливают во флаконы на 10 равных порций. Посевы воды помещают в термостат на 18-24 часа при 37°C.

2.4. Посев воды по методу Ростовского-на-Дону НИИЭМГ (по Р.С. Хомик и А.А. Рындич). Применяется только для шигелл.

В 0,5-1 л исследуемой воды добавляют 5-10 мл 1% мясопептонного бульона и помещают в термостат при 37°C на 18-24 часа. Затем произвести посев на среду Эндо, ЭСМ-агар и бактоагар Плоскирева петлей. В этот же день провести посев подращенный в мясопептонном бульоне воды в среды накопления: 10% желчный бульон или селенитовый бульон, произведя разведение до (берут 0,5 мл воды на 4,5 мл среды накопления). Из разведений делают высев на среды Эндо и ЭМС-агар (по 0,1 мл на каждую чашку) и бактоагар Плоскирева. Чашки с посевами и разведения, откуда делали высев, помещают в термостат при 37°C на 18-24 часа. На следующий день просматривают чашки, а из разведений делают еще один высев на те же плотные среды. Дальнейшее исследование - по общепринятой методике определения шигелл.

3. Высев на дифференциально-диагностические среды.

3.1. Для определения сальмонелл.

Используют висмут-сульфитный агар. Высев из сред накопления производят бактериологической петлей на 2-3 чашки. Посевы инкубируют при 37°C 18-24 часа. Просматривают рост на чашках и дальнейшее исследование проводят по общепринятой методике.

3.2. Для определения шигелл.

Используют агар с эозин-метиленовым синим с антибиотиками и без них, бактоагар Плоскирева. Высев из сред накопления производят бактериологической петлей на не менее 5 чашек. Посевы инкубируют в термостате при 37°C 18-24 часа. Просматривают рост на чашках и дальнейшее исследование проводят по общепринятой методике.

4. Ускоренные методы определения сальмонелл и шигелл в воде.

Ускоренные методы определения патогенных энтеробактерий в воде рекомендуется использовать при повторном контроле воды централизованного и нецентрализованного водоснабжения, из которой ранее были выделены сальмонеллы или шигеллы.

4.1. Ускоренный сигнальный метод индикации патогенных энтеробактерий в питьевой воде.

Питьевую воду отбирают в количестве 1-2 л. Для посева воды используют параллельно не менее двух сред накопления: среду с охмеленным суслом, магниевую или селенитовую среды. 500 мл исследуемой воды засевают в равное количество магниевой или селенитовой сред двойной концентрации или среды с охмеленным суслом по прописи. Навеску сухой среды с охмеленным суслом в количестве 10 г вносят в 500 мл воды, взбалтывают до растворения в воде. Посевы инкубируют при 37°C 18-24 часа.

Через 6 часов инкубации (ранний высев) из сред накопления три объема по 10 мл фильтруют через мембранные фильтры N 3. На первый фильтр наносят агглютинирующую специфическую сыворотку в количестве 0,5 мл. С помощью бактериологической петли смывают осадок с фильтра, переносят на предметное стекло и проводят реакцию агглютинации. Два фильтра укладывают на поверхность висмут-сульфитного агара для подращивания сальмонелл и на ЭМС-агар - для шигелл. Посевы на чашках инкубируют при 37°C 18-24 часа.

Положительная реакция агглютинации может служить сигнальным ответом на наличие соответствующих патогенных энтеробактерий.

Для подтверждения сигнального ответа:

1. На следующий день просматривают рост на фильтрах и, если есть четкие колонии, с каждой проводят пробную реакцию агглютинации на стекле с соответствующей специфической агглютинирующей сывороткой, готовят мазок и окрашивают по Граму. При обнаружении грамотрицательных палочек, дающих реакцию со специфической сывороткой, может быть дан предварительный положительный ответ. Все колонии, которые дали положительную реакцию агглютинации, пересевают на чашки с дифференциально-диагностическими средами и дальнейшее выделение и идентификацию бактерий проводят по общепринятой методике.

2. Наряду с этим, через 18-24 часа из сред накопления производят высев петлей на плотные питательные среды: висмут-сульфитный агар и ЭМС-агар с антибиотиком и без него, в зависимости от того, какие штаммы выделяются в данном районе - антибиотикоустойчивые или чувствительные. Посевы инкубируют при 37°C 18-24 часа. Дальнейшее исследование и идентификация выделенных бактерий проводятся по общепринятой методике выделения сальмонелл и шигелл.

4.2. Ускоренное обнаружение сальмонелл в воде централизованного и нецентрализованного водоснабжения с использованием метода люминесцирующих антител.

С помощью красителя бисмарк браун приготавливают нелюминесцирующие мембранные фильтры по способу (Л.Е. Корш и Т.З. Артемовой (1972)). Пробы воды, подозрительные на наличие сальмонелл, фильтруют по 100 мл через 5 мембранных фильтров. Поверхность фильтров обрабатывают кроличьей агглютинирующей специфической сальмонеллезной сывороткой или смесью сывороток. Через 10-15 мин препарат помещают на 20 мин во влажную камеру, после чего подсушивают на воздухе. Затем фильтры обрабатывают люминесцирующей сывороткой против глобулинов кролика, время окраски - от 15 до 30 мин во влажной камере при комнатной температуре. Фильтры высушивают на воздухе, помещают на предметное стекло между слоями нелюминесцирующего иммерсионного масла (парафинового или вазелинового), накрывают покровным стеклом, на которое помещают еще каплю иммерсионного масла, и препарат микроскопируют.

Для люминесцентных микроскопов МЛ-2 используют светофильтры БС 8-2, СС 15-2, ФС 1-2, запирающий фильтр Т-2-Н, окуляторы компенсационные или . Препарат просматривают в падающем свете под ахроматическим иммерсионным объектом 90x1,25 Л.

При специфическом свечении наблюдается люминесценция по периферии микробной клетки, четко контрастирующая с телом клетки. Окрашенные и высушенные препараты могут храниться в темном месте в течение нескольких недель.

При использовании микроскопа МЛ-2Б возможно ориентировочное количественное определение сальмонелл в воде, для чего в один из измерительных окуляров вставляется окулярная сетка Гаженко. Определение ведут по формуле:

где X - количество сальмонелл в 1 мл воды, S - площадь фильтрующей поверхности в мкм, - площадь 1 квадрата сетки Гаженко в мкм, n - количество клеток сальмонелл в 1 квадрате (среднее арифметическое из 20 квадратов), V - объем профильтрованной воды в мл.

Для повышения специфичности результатов анализа воды бактерии, задержавшиеся на нелюминесцирующих фильтрах, подращивают на висмут-сульфитном агаре в течение 3-4 часов при 37°C. Образовавшиеся микроколонии обрабатывают и микроскопируют так же, как и отдельные бактерии. Для получения достоверных результатов необходим контроль специфичности.

Затраты времени на анализ: без подращивания - 1-1,5 час., с подращиванием - до 5 часов.

III. Среды определения сальмонелл и шигелл в воде

1. Магниевая среда.

Навески ингредиентов на исследуемые объемы жидкости	500 мл	100 мл
Магний хлористый кристаллический	19,5 г	3,9 г
Натрий хлористый	4,0 г	0,8 г
Калий фосфорнокислый однозамещенный	0,8 г	0,16 г
Пептон, 10% раствор	25 мл	5 мл
Дрожжевой экстракт	11,0 мл	2,5 мл
Бриллиантовый зеленый, 0,1% водный раствор	2,5 мл	0,5 мл

Все ингредиенты вносят в исследуемую воду, растворяют.

2. Среда с охмеленным суслом.

Готовится ex temporae.

125 мл охмеленного сусла наливают в стерильную посуду, добавляют 6,25 г пептона, размешивают, ставят на огонь, доводят до кипения и варят на медленном огне в течение 10 мин, остужают, приливают 500 мл исследуемой воды, 8,7 мл 0,1% раствора бриллиантового зеленого, приблизительно 15 капель 20% раствора NaOH, доводя pH содержимого до 7,2-7,4.

3. Селенитовый бульон.

а) Приготовление основного раствора (буфера).

В стерильную колбу наливают 1 л дистиллированной воды, добавляют 10 г пептона, растворяют нагреванием, добавляют 6 г натрия фосфорнокислого однозамещенного безводного, 14 г натрия фосфорнокислого двузамещенного безводного, 8 г лактозы. Тщательно перемешивают, фильтруют, стерилизуют при 0,5 атм. Основной раствор хранится в холодильнике 1-2 месяца.

б) Приготовление 10% раствора натрия кислого селенистокислого.

В 100 мл дистиллированной воды растворяют 10 г натрия кислого селенистокислого. Раствор готовят ex temporae. К 500 мл исследуемой воды добавляют 500 мл основного раствора, 40 мл 10% раствора натрия кислого селенистокислого.

4. Среда Кауфмана.

К 1000 мл среды Мюллера добавляют 50 мл стерильной бычьей желчи, 10 мл 0,1% водного раствора бриллиантового зеленого. Перемешивают и разливают в стерильную посуду.

5. Агар с эозин-метиленовым синим с антибиотиком.

На 1 л свежеприготовленной среды (до застывания) добавляют 8 мл 0,5% раствора синтомицина или 5 мл 0,5% раствора левомицетина, после чего среду разливают на чашки.

6. Трехсахарный агар с мочевиной (среда Олькеницкого).

Дистиллированной воды 100 мл, сухого питательного агара 2,5 г, лактозы 1 г, сахарозы 1 г, глюкозы 0,1 г, мочевины 1 г, соли Мора 0,02 г, тиосульфата натрия 0,03 г, 0,4% водного раствора фенолового красного 0,4 мл. Все тщательно перемешивают, устанавливают pH 7,2-7,4, разливают в пробирки и стерилизуют текучим паром в течение 20 мин 3 дня подряд. После стерилизации среду скашивают, оставляя столбик высотой 5 см. Готовая среда - бледно-розового цвета.

Начальник Главного управления карантинных инфекций Министерства здравоохранения СССР

В.П. Сергиев