Методические указания по лабораторной диагностике пастереллезов животных и птиц (утв. Главным управлением ветеринарии от 20 августа 1992 г. N 22-7/82)

1. Общие положения

1.1. Пастереллезы - различные по локализации и характеру течения инфекционные болезни сельскохозяйственных, домашних и диких животных, птиц и человека, вызываемые бактериями рода Pasteriolla который включает в себя шесть видов: P.multocida, P.haemolytica, P.ureae, P.pneumotropica, P.aerogenes, P.gallinarum

1.2. Ведущее этиологическое значение в инфекционной патологии животных и птиц принадлежит двум видам: P.muluocide, P.haemolytice.

P.muluocida является возбудителем геморрагической септицемии животных, холеры птиц, а также легочных пастереллезов, осложняющих респираторные инфекции вирусной и микоплазменной этиологии.

P. haemoytica вызывает у крупного рогатого скота и овец всех возрастов пневмонии, а также септицемию новорожденных ягнят.

Кроме перечисленных заболеваний эти два вида могут выделяться у коров и свиноматок при абортах, у овец и коров - при маститах, у телят и ягнят - при артритах и других локальных патологических процессах.

1.3. Краткие сведения о других видах пастерелл.

P. pneumotropica является возбудителем энзоотического заболевания мышей, кроликов и других лабораторных грызунов, которое проявляется поражением органов дыхания и образованием абсцессов.

P. ureae часто выделяют от человека при хроническом атрофическом насморке.

P. gallinarum встречается как комменсал верхних дыхательных путей птиц и иногда крупного и мелкого рогатого скота; имеет низкую вирулентность и чаще ассоциирует с хроническими респираторными инфекциями птиц.

P. aerogenes является постоянным обитателем кишечного тракта свиней.

1.4. Диагноз на пастереллезы устанавливают на основании эпизоотологических данных, клинических признаков, патологоанатомических изменений и результатов лабораторного исследования.

1.5. Лабораторная диагностика пастереллезов включает микроскопию мазков и отпечатков, выделение культур пастерелл и их идентификацию и при необходимости постановку биопроб.

1.6. Для исследования в лабораторию направляют 2-3 трупа мелких животных, от крупных животных - сердце с перевязанными сосудами, части селезенки, печени, почек, экссудат из грудной полости и трубчатую кость. При поражении легких берут также их кусочки (5X5 см) на границе нормального и измененного участков, миндалины, бронхиальные, средостенные и заглоточные лимфатические узлы.

Патологический материал берут от павших (не позднее 3-5 ч после гибели) или убитых животных, не подвергавшихся лечению антибактериальными препаратами.

Для диагностики пастереллеза у птиц в лабораторию направляют, кроме свежих трупов, 5-6 живых птиц с явными признаками болезни. Больную птицу убивают в лаборатории и делают высевы из костного мозга, сердца, печени и селезенки.

1.7. Взятие и доставку материала осуществляют в соответствии с действующими Правилами взятия патологического материала, крови, кормов, и пересылки их для лабораторного исследования.

2. Выделение и идентификация культур

2.1. посевы из патологического материала, перечисленного в п. 1.6, делают в МПБ и на МПА или бульон и агар Хоттингера рН 7,2-7,4 с добавлением 10% нормальной сыворотки крови лошади (см. приложение пп. 1-4) или 5-10% аминопептида-2.

2.1.1. Посев в пробирки с жидкими и твердыми питательными средами проводят пастеровской пипеткой. Пробирки с посевами инкубируют при 37-38 градусов в течение 20-48 часов.

2.1.2. Одновременно с посевами из каждого органа делают мазки-отпечатки, фиксируют 10-15 мин смесью равных объемов этилового спирта и эфира, окрашивают по Леффлеру или Романовскому-Гимза и микроскопируют. В мазках из патологического материала пастереллы выглядят овоиды или короткие палочки с закругленными концами и заметной биполярностью, вокруг которых может быть видна прозрачная капсула.

2.2. В жидких питательных средах рост пастерелл сопровождается сначала слабым помутнением, затем через 24-36 часов возможно просветление среды и выпадение на дно пробирки осадка, поднимающегося при встряхивании в виде косички.

На сывороточном агаре или агаре с аминопептидом-2 пастереллы растут в виде прозрачных, средней (диаметром до 3 мм), округлых с ровными краями колоний слизистой консистенции, серого цвета.

На простых питательных средах без добавления сыворотки крови пастереллы растут не всегда удовлетворительно.

У выделенных культур изучают культуральные, тинкториальные и морфологические свойства. В мазках из культур при окраске по Граму пастереллы имеют вид грамотрицательных овоидов или коккобактерий, расположенных одиночно и попарно.

Идентификацию выделенных культур проводят по ферментативным свойствам и подвижности.

ГАРАНТ:

Здесь и далее по тексту нумерация приводится в соответствии с источником

2.3.1. Суточную агаровую культуру высеевают в среды Гисса с глюкозой, маннитам, сахарозой, маннозой, в ПМА, молоко, желатин, на кровяной сывороточной МПА или агар Хоттингера (см. приложение п. 5), в МПБ с 1% нитрата калия, в среду с мочевиной (см. приложение п. 6).

2.3.2. Для определения редукции нитратов исследуемые культуры засевают в МПБ с 1% нитрата калия и выращиванием в течение 48-72 ч.

Затем в пробирку добавляют 1 куб см 2%-ного водного раствора крахмала, 1 куб см 1%-ного раствора йодистого калия и 1-2 капли 5%-ного водного раствора серной кислоты и взбалтывают.

При положительной реакции среда приобретает окраску от темно-синего до коричневого цвета; при отрицательной - цвет среды желтый или слабо синий.

2.3.3. Индол выявляют с помощью индикаторных бумажек или по методу Легаль-Вейла. Индикаторные бумажки готовят из полосок фильтровальной бумаги длиной 10-12 см, пропитывая их горячей щавелевой кислотой, высушивают в термостате и хранят в банке с притертой пробкой.

С целью выявления индола в пробирку с МПБ после засева культуры под ватную пробку помещают полоску индикаторной бумажки с таким расчетом, чтобы нижний ее конец не касался среды, и инкубируют при 37 градусах С 24-72 ч. При выделении индола нижняя часть бумажки приобретает розовую окраску.

Метод Легаль-Вейла. В пробирку с суточной бульонной культурой пастерелл вносят 4-5 капель 5%-ного водного раствора нитропруссида натрия, перемешивают и добавляют вначале такой же объем 40%-ного водного раствора N2OH, а спустя 1-2 мин 4-5 капель ледяной уксусной кислоты. При наличие индола бульонная культура приобретает сине-зеленую окраску.

2.3.4. Для определения уреазы в пробирку, содержащую среду с мочевиной, закапывают 2-3 капли 24-часовой изучаемой бульонной культуры. Посевы культивируют 20-24 ч. при 37 гр. С. При наличии фермента уреазы происходит покраснение среды.

2.3.5. Все виды пастерелл неподвижны, не свертывают молоко, не разжижают желатин, редуцируют нитраты, ферментируют с образованием кислоты без выделения глаза глюкозу, маннозу, сахарозу.

P.agrogenes в отличие от других видов ферментирует углеводы с выделением газа.

На кровяном сывороточном МПА или агаре Хоттингера P.haemolytica образует колонии с отчетливой зоной гемолиза, которая лучше просматривается после снятия колонии со среды. Остальные виды пастерелл гемолиза не вызывает.

2.3.6. Основные дифференцирующие признаки видов рода пастерелла представлены в таблице.

Признаки	P.multo-cida	P.pneumo-tropica	P.haemo-lytica	P.ureae	P.aero-genes	P.galli-narum
Гемолиз на кровяном агаре	-	-	+	-	-	-
Образование индола	+	+	-	-	-	-
Наличие уреазы	-	+	-	+	+	-
Ферментация маннита	+	-	+	+	-	-

Условные обозначения: + результат положительный

- результат отрицательный

2.4. Дифференциация серовариантов Р.

2.4.1. Изучаемую 18-часовую бульонную культуру бактериологической петлей высевают на чашку Петри со свежеприготовленным 1,5%-ным агаром Хоттингера. Посев проводят, не отрывая петли от поверхности агара, параллельными штрихами на расстоянии 7-10 мм один от другого.

Затем бактериологической петлей одним штрихом по диаметру чашки, перпендикулярно нанесенным штрихам, высевают суточную бульонную культуру Staphylococcus aureus (культура должна обладать хорошей гемолитической активностью, что определяют высевом ее на кровяной сывороточный МПА).

Чашки с посевами инкубируют при 37 градусов С и через 18-24 час учитывают результаты.

Штаммы, образующие вблизи (до 5 мм) от линии роста стафилококка более мелкие колонии, чем на удалении от этой линии, относятся к сероварианту А. Кроме того колонии P. multocida сероварианта А, растущие вблизи стафилококка, при просмотре в проходящем свете имеют окраску в отличие от остальных флуоресцирующих колоний. Размер колоний серовариантов В и Д в данном тесте не изменяются.

2.4.2. Исследуемую бульонную культуру (5-6 куб см) центрифугируют при 3000 об/мин.

Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспензируют в оставшейся в пробирке надосадочной жидкости до получения гомогенной суспензии. К полученной суспензии приливают 0,5 куб см водного свежеприготовленного раствора акрифлавина 1:1000 и тщательно перемешивают.

Штаммы, относящиеся к сероварианту Д, в течении 10-15 мин после добавления раствора акрифлавина образуют крупнохлопчатый неразбивающийся при встряхивании флоккулят. Кроме штаммов P. multocida сероварианта Д, флоккулят могут образовывать диссоциированные культуры других серовариантов, но в этом случае флоккулят мелкохлопчатый и легко разбивается при встряхивании.

Сероварианты Ф и В дают отрицательную реакцию флоккуляции.

2.4.3. Штаммы P multocida, не обладающие указанными выше свойствами, относятся к сероварианту В.

3. Биологическое исследование

3.1. Биологическое исследование проводят для определения патогенности выделенной культуры пастерелл и при необходимости с целью обнаружения возбудителя в патологическом материале.

3.2. Патогенность культур определяют на белых мышах массой 16-18 гр. С этой целью двум белым мышам вводят подкожно по 0,2 куб см 18-24 - часовой бульонной культуры.

Вирулентные штаммы P. multocida, относящиеся в основном к сероварианту В и являющиеся возбудителями геморрагической септицемии, вызывают гибель зараженных белых мышей в течении 24-72 час; слабовирулентные штаммы серовариантов А и Д, участвующие в развитии пневмоний - через более продолжительный срок (до 7 сут.).

P.haemolytica может вызвать гибель белых мышей только при внутрибрюшинном заражении. Остальные виды пастерелл, как правило, для лабораторных животных непатогенны.

3.3. Патогенность культур, выделенных от птиц, проверяют на белых мышах или цыплятах. Суточную бульонную культуру вводят двум белым мышам внутрибрюшинно по 0,2 куб см или двум цыплятам 90-120 - дневного возраста внутримышечно по 1,0 куб см.

3.4. Для обнаружения возбудителя пастереллеза в патологическом материале суспензий из органов (см. п. 1.6) заражают двух белых мышей подкожно в дозе 0,2 куб см. При этом надо учитывать, что не все виды пастерелл, играющие роль в патологии сельскохозяйственных животных, вызывают гибель зараженных белых мышей.

3.5. Культуру считают патогенной, а биопробу положительной при гибели через 24-72 ч хотя бы одного из зараженных животных и выделении от него культуры пастерелл.

3.6. Срок наблюдения за зараженными животными - 7 сут.

4. Диагноз считают установленным в случае:

- выделение из патологического материала культуры со свойствами, характерными для возбудителя пастереллеза, и установления ее патогенности на лабораторных животных;

- гибели хотя бы одного лабораторного животного из двух зараженных исходным материалом и выделения из его органов культуры со свойствами, характерными для возбудителя пастереллеза, если даже в посевах из исходного материала культуры возбудителя не выделено.

С утверждением настоящих методических указаний утрачивает силу. Наставления по лабораторной диагностике пастереллеза птиц, рекомендованные Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 20.05.75 г.

Заместитель начальника Главного управления ветеринарии

В.М. Авилов