Инструкция по санитарно-бактериологическому исследованию почвы населенных мест (утв. Главным государственным санитарным инспектором СССР 19 февраля 1958 г. N 268-58)

1. Санитарно-бактериологические исследования почвы включают в себя:

1) Выбор места для взятия проб почвы.

2) Забор проб почвы.

3) Подготовка и обработка почвы для анализа.

4) Определение общего числа сапрофитных бактерий.

5) Определение микроорганизмов - показателей фекального загрязнения.

6) Вас. perfringens.

7) Bac. proteus.

При эпидпоказаниях производится определение наличия в почве патогенных микроорганизмов:

а) тифозно-паратифозной группы;

б) Bac. tetani;

в) Bac. botulinus.

2. Для изучения степени загрязнения почвы населенных мест, обследованию подлежат территории дворов, улиц, рынков, детских и спортивных площадок, столовых, территории предприятий пищевой промышленности и т.д.

Изучению также подлежат почвы полей орошения и огородов.

I. Выбор места для взятия проб почвы

3. Выбор места для забора проб почвы определяется санитарным врачом и бактериологом с учетом задания и цели исследования, а также:

а) топографии местности;

б) почвенного и растительного покрова;

в) физического строения почвы.

4. В сопроводительной к анализу необходимо указать площадь исследуемой территории, наличие или отсутствие канализации, расположение источников загрязнения, характера почвы и т.д.

5. На обследуемой территории до 1000 нужно выделить два участка площадью в 25 каждый. Одна площадка выбирается вблизи источников загрязнения (выгреб, мусорный ящик и т.д.), другую площадку выделяют на том же участке вдали от источника загрязнения.

6. С каждого участка площадью в 25 (п. 5) составляется средний образец из индивидуальных проб, взятых в 5 точках по диагонали участка или в 4-х точках по краям и одна в центре.

7. Глубина забора проб почвы решается санитарным врачом совместно с бактериологом в зависимости от поставленной задачи.

8. При изучении бактериального загрязнения поверхностных слоев почвы населенных мест, для анализа берут слой почвы до 20 см. Нередко ее подразделяют на более мелкие слои - до 10 см.

9. Для взятия средней пробы почвы до глубины 20 см из отдельных точек участка (п. 6) выкапывают лопатой небольшой монолит до нужной глубины и от него отделяют навеску в 200 - 300 г, помещают в стерильную посуду и хорошо перемешивают стерильной ложкой. Смешанные образцы почвы должны весить не менее 1 кг.

10. С участков полей орошения и огородов необходимо брать пробы на глубине до 20 см соответственно росту корнеплодов. Средняя проба почвы составляется из 3-х индивидуально взятых образцов с каждой гряды. На тех же участках забирается средний образец почвы с борозды.

11. Из средней смешанной пробы (п. 9) для анализа отбирают около 200 - 300 г почвы, переносят в стерильную банку и закрывают ватной пробкой горлышко банки. Дополнительно закрывают бумагой и перевязывают шпагатом. К банке приклеивают или привязывают этикетку с датой и номером взятой пробы почвы.

12. В случае необходимости изучения влияния загрязнений почвы на санитарное состояние грунтовых (артезианских) и речных вод, служащих источниками водоснабжения, пробы почвы следует брать на глубине до 0,75 - 2 м в зависимости от физических свойств почвы.

13. Образцы из глубоких слоев почвы (0,75 - 2 м) берут буром системы Некрасова. При отсутствии бура делается разрез почвы: выкапывается яма нужной глубины и стерильной маленькой лопатой или ножом забираются образцы почвы с отвесной стены ямы соответственно каждому слою. Пробы почвы следует брать осторожно, чтобы не загрязнять их вышележащими слоями почвы.

14. В дальнейшем поступают как указано в п. 11.

После забора проб почвы последние немедленно транспортируются в лабораторию в деревянном ящике с гнездами для каждой пробы почвы.

15. При отсутствии возможности приступить к обработке почвы в тот же день, допускается хранение почвы в холодильнике не более 24 часов.

II. Подготовка и обработка почвы для анализа

16. Образцы почвы освобождаются от всякого рода включений корней, камешков, щебня, стекла и т.д. Крупные агрегаты почвы нужно предварительно раздробить, после чего образец тщательно перемешивают и из него отбирают навеску не меньше 30 г для разведения.

Приготовление почвенной болтушки и разведений

17. Первое разведение навески почвы в 30 г делают в сосуде (емкостью 500 г) с 300 мл стерильной водопроводной воды. После взбалтывания в Шюттель-аппарате (при отсутствии последнего допускается взбалтывать вручную) в течение 10 мин. и из полученной почвенной суспензии без отстаивания делают последующие разведения.

18. Из первоначально приготовленной суспензии (1:10) берут стерильной пипеткой 1 мл и переносят ее в пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды. Получают разведение почвы в 100 раз. Затем из этой пробирки, после тщательного перемешивания ее содержимого, новой стерильной пипеткой вносят 1 мл предыдущего разведения в следующую пробирку с 9 мл стерильной воды. Таким образом, приготовляют несколько разведений: для чистых почв до 3-4 разведений (1:1000, 1:10 000), для загрязненных до 4-6 разведений (1:10 000-1 000 000).

III. Определение общего числа бактерий
Посев

19. Из каждой пробы почвы должно быть использовано для посева не менее двух различных разведений в зависимости от степени предполагаемого загрязнения исследуемой почвы.

20. Перед посевом каждое разведение в пробирках (п. 18) тщательно перемешивают стерильной пипеткой, после чего берут 1 мл суспензии и переносят на дно стерильной чашки под слегка приподнятую крышку. Из каждого разведения должен быть сделан посев минимум на 2 параллельные чашки. При переносе от одного разведения к другому пипетку меняют.

После посева в каждую чашку вливают предварительно расплавленный и остуженный до 45° мясо-пептонный агар в количестве 15 мл. Края пробирки или другой посуды, в которой находится растопленный мясо-пептонный агар, перед розливом обжигаются.

21. Чашки Петри с расплавленным мясо-пептонным агаром хорошо перемешивают с имеющейся там почвенной суспензией, осторожно наклоняя чашку во все стороны. Для равномерного распределения питательной среды по дну чашки Петри, последнюю ставят затем на строго горизонтальную поверхность до затвердения мясо-пептонного агара.

22. На крышке чашки должна быть сделана надпись с указанием номера или названия пробы и разведения.

23. После застывания агара, чашки с посевом помещают в термостат в перевернутом виде (крышкой вниз) при температуре 28 - 30° на 48 часов. Если выращивание производится при более низких температурах - срок инкубации должен быть увеличен до 72 часов.

24. После посева подсчитывают выросшие колонии.

Счет колоний

25. Для подсчета бактерий необходимо брать такие разведения, при которых на чашках вырастает от 50 до 150 колоний.

Примечание: Если на чашках выросло больше 150 колоний и нет других разведений, допускается подсчет колоний на части чашки с последующим пересчетом на всю ее площадь.

26. Из суммы колоний, выросших на двух чашках (п. 20) выводят средне-арифметическое число и затем подсчитывают число колоний, приходящихся на 1 г почвы.

Пример. Посеяно 1 мл почвенной суспензии из разведений в 10 000. На всей площади чашки выросло 80 колоний. Эту цифру надо помножить на степень разведения (10 000), получаем, что в 1 г почвы содержится 800 000 бактерий.

27. Учет общего количества сапрофитных бактерий в почве следует заносить в протоколы анализа по следующей схеме:

Наименование участка	Подсчет колоний в разведениях 1:0000	Количество колоний в 1 г почвы
Двор жилого дома	90) Среднее 70) 80	800 000

IV. Определение количества бактерий группы кишечной палочки в почве

А. Основные положения

28. Санитарно-показательными микроорганизмами фекального загрязнения являются все разновидности группы кишечной палочки, а именно:

а) короткие грам-отрицательные неспороносные палочки,

б) аэробы или факультативные анаэробы;

в) сбраживающие кислоты с образованием кислоты и газа при 43°С.

Б. Посев и выращивание
Этап - бродильная проба

29. Наличие микробов группы кишечной палочки выявляют посевом различных количеств почвы в бродильные сосуды с модифицированной средой Кесслера-Свенертона.

30. При анализе чистых почв посев производят от 10 мл почвенной суспензии основного разведения 1:10 (п. 17) до 1:1000.

При работе с загрязненными почвами используют разведения до 1:1 000 000.

31. Из исходного разведения (1:10) берут стерильной пипеткой 10 мл и засевают в колбу с 50 мл среды Кесслера-Свенертона, что соответствует 1 г почвы.

Посев меньших количеств 0,1 - 0,01 и т.д. делают по 1 мл из соответствующих разведений почвенной суспензии (п. 17) в пробирки с 9 мл той же среды. При переходе от одного разведения к другому стерильную пипетку надо менять.

32. Посевы выращивают в термостате при 43° (при отсутствии термостата на 43°, можно выращивать при 37°). В случае задержки роста, посев оставляют в термостатах еще на сутки.

33. Отсутствие через 18 - 24 часа газообразования и мути в бродильных сосудах дает окончательный отрицательный ответ на наличие кишечной палочки.

34. Дальнейший ход анализа почвы из забродивших сосудов на группу кишечной палочки проводится по общепринятому методу исследования воды.

35. Результаты анализа следует приводить в протоколах по указанной ниже схеме:

Схема протокольной записи

Дата исследования	NN проб	Место забора проб почвы	Бродильный титр в разведениях					Коли-титр	Колииндекс
			1,0
25/VII	1	Почва домовладения	Муть газ	Муть газ	Муть газ	Муть газ	Муть газ	0,001	960000

36. Результаты анализа выражают коли-индексом, т.е. количество бактерий кишечной палочки, приходящихся на 1 г почвы, и коли-титром - наименьшее количество разведений почвы, выраженное в граммах, внесение которого в питательную среду вызывает развитие кишечной группы бактерий.

37. Для вычисления коли-титра и коли-индекса можно пользоваться таблицами расчета, составленными для исследования воды открытых водоемов, при этом надо пользоваться посевами из расчета, соответствующего таблицам 1 и 2.

Ориентировочный анализ объема: 1,0, 0,1, 0,01 и 0,001 мл.

1,0	0,1	0,01	0,001	Коли-индекс	Коли-титр
-	-	-	-	менее 900	более 1,11
-	-	-	-	900	1,11
-	-	+	-	900	1,11
-	+	-	-	950	1,05
-	-	+	+	1800	0,56
-	+	-	+	1900	0,53
-	+	+	-	2200	0,46
+	-	-	-	2300	0,43
-	+	+	+	2800	0,36
+	-	-	+	9200	0,11
+	-	+	-	9400	0,10
+	-	+	+	18000	0,06
+	+	-	-	23000	0,04
+	+	-	+	96000	0,01
+	+	+	-	238000	0,004
+	+	+	+	более	менее
				238000	0,004

Ориентировочный анализ объема: 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001.

0,1	0,01	0,001	0,0001	Коли-индекс	Коли-титр
-	-	-	-	менее 9000	более 0,111
-	-	-	+	9000	0,111
-	-	+	-	9000	0,111
-	+	-	-	9500	0,105
-	-	+	+	18000	0,056
-	+	-	+	19000	0,053
-	+	+	-	22000	0,046
+	-	-	-	23000	0,043
-	+	+	+	28000	0,036
+	-	-	+	92000	0,011
+	-	+	-	94000	0,010
+	-	+	+	180000	0,006
+	+	-	-	23000	0,004
+	+	-	+	960000	0,001
+	+	+	-	2380000	0,0004
+	+	+	+	более 2380000	менее 0,0004

V. Определение титра bac. perfringens в почве

38. Определение титра bac. perfringens в почве производится путем посева 9-кратных разведений основной почвенной суспензии (п. 31), применяемой для определения коли-титра.

39. Из каждого разведения берут стерильной пипеткой по 1 мл и засевают в пробирки с молоком, розлитым по 5 мл. При переходе от одного разведения к другому пипетку надо менять.

40. Для освобождения от неспороносной микрофлоры все посевы с разведениями почвенной суспензии прогревают в водяной бане при 80° в течение 15 минут.

41. Посевы выращивают в термостате при 37° (лучше при 43°) в течение 18 - 20 час.

42. Наличие bac. perfringens регистрируется по наступившему характерному свертыванию молока с полным отделением сыворотки и выбрасыванию губчатого свертка на поверхность благодаря энергичному газообразованию.

43. Присутствие bac. perfringens подтверждается бактериоскопическим нахождением в мазках из содержимого пробирок типичных крупных толстых грам-положительных палочек.

44. Предельное разведение почвенной суспензии, которое дает на молочной среде развитие колоний bac. perfringens, показывает титр этого микроба в почве.

Санитарная оценка степени загрязнения почвы

Почва	Титр кишечной палочки в граммах	Титр Вас. perfingens (в граммах)
Относительно чистая	1,0 и выше	0,1 и выше
Слабо загрязненная	0,1 - 0,01	0,01 - 0,001
Сильно загрязненная	0,001 и ниже	0,0001 и ниже

VI. Определение bac. proteus в почве

45. При исследовании почвы на наличие bac. proteus приготовляют разведения из основной почвенной суспензии (п. 17) вплоть до 0,0001.

46. Из каждого разведения (п. 18) стерильной пипеткой берут 1 мл суспензии и вносят в конденсационную воду свежескошенного мясо-пептонного агара (по методу Шукевича). При этом поверхность питательной среды не должна загрязняться вносимой почвой.

47. Зараженные пробирки с мясо-пептонным агаром ставят в термостат при 37°.

48. Через 24 - 48 час. рост bac. proteus обнаруживается в виде тонкой вуалеобразной пленки, ползущей по поверхности агара.

49. Для bac. proteus характерно полиморфность клеток, их подвижность и способность быстро распространяться по поверхности скошенного мясо-пептонного агара. Вас. proteus не ферментирует маннит в средах Гисса, глюкозу, мальтозу и сахарозу ферментирует с образованием газа. Дает положительную реакцию в бульоне на сероводород и индол.

VII. Исследование почвы на наличие в ней тифозно-паратифозных и дизентерийных микробов

50. Для исследования берется навеска почвы не менее 30 г. Посев почвы производится из основного разведения почвы (1:10) в стерильной водопроводной воде как указано в п. 17. "Подготовка почвы для анализа".

51. Почвенную суспензию, после ее приготовления и последующего отстаивания около одной минуты, осторожно сливают с осевшего осадка в другой стерильный сосуд для освобождения от грубых механических примесей.

52. Для концентрации микробов к 500 мл почвенной суспензии добавляют 2 мл 10% стерильного раствора соды и затем 1,7 мл 10% стерильного раствора сернокислой окиси железа . Размешивают и оставляют на холоде на один час.

Образовавшиеся после коагуляции хлопья оседают на дно сосуда вместе с частицами почвы и бактериями.

Осадок вместе с оставшейся жидкостью центрифугируют 5 минут. Сливают прозрачную жидкость над осадком, а осадок растворяют в 25% стерильном растворе винокаменнокислого калия.

53. Осадок после коагуляции (п. 52) засевают в количестве по 0,5 - 1 мл на 2 плотные элективные среды: Плоскирева, Вильсон, Блера и др. Для получения изолированных колоний на чашке со средой производят рассев внесенного в чашку осадка с помощью стерильного шпателя. Этим же шпателем заражают поверхность среды еще 3-4-х чашек. Такой рассев позволяет получить изолированные колонии.

54. Оставшийся осадок почвенной суспензии заливают 50 мл 10% желчным бульоном.

55. Посевы выращивают в термостате при 37°.

56. Из среды обогащения (п. 54) производят высев на плотные элективные среды через 5-6 час. (ранний высев) и дополнительный высев через 18 - 20 час.

57. Просматривают посев на чашках (п. 54 - 56) и отбирают колонии подозрительные на патогенные микробы на среде Плоскирева, прозрачные, бесцветные, голубоватые или слегка мутные, с неровными краями, плоские, сходные с бактериями Зонне. На висмутсульфитной среде тифо-паратифозные колонии растут в виде черных колоний со светлым блестящим ободком.

58. Подозрительные колонии отвивают не менее 5 с каждой чашки на среду Ресселя или розоловую дифференциальную среду, содержащую лактозу и глюкозу.

59. Выделенные культуры помещают в термостат при 37° на 18 - 20 часов.

Дальнейшее изучение морфологических, ферментативных и серологических свойств выделенных культур (п. 54 и 57) проводится по общепринятой методике для каждого вида микробов.

VIII. Исследование почвы на наличие в ней bac. tetani

60. Навеску почвы в 20 - 30 г растирают в стерильной фарфоровой ступке, отбирают из нее 3 - 5 г и разводят в стерильном физиологическом растворе.

61. Полученную почвенную взвесь тщательно встряхивают и отстаивают при комнатной температуре (18 - 20°) 3 - 4 часа.

62. Берут 1 мл почвенной взвеси и вводят белым мышам под кожу правой задней лапки. Перед введением взвесь слегка взбалтывают в пробирке. Каждую пробу земли испытывают на двух мышах.

63. Одновременно ставят контрольный опыт: перед введением мышам взвеси почвы, им предварительно вводят специфическую противостолбнячную сыворотку.

64. Гибель первых животных (п. 62) с характерным "симптомом" (нарушение функций конечностей, хвост вытягивается "трубой", возникает искривление позвоночника), а вторая привитая мышь (п. 63) остается живой - указывает на наличие столбнячного токсина.

65. Бактериологический посев производят из почвенной суспензии (приготовленной, как указано в п. 60) в колбочку с сахарным бульоном. В дальнейшем анализ проводят по общей методике выделения культур анаэробов.

IX. Исследование почвы на наличие в ней bac. botulinus

66. Берут 2 навески почвы в 20 - 30 г и каждую из них растирают в стерильной фарфоровой ступке и вносят в колбу, наполненную 80 - 100 мл среды Китт-Тароцци.

67. Одну из этих колб с посевом почвы надо подогреть до 80° и при этой температуре продержать 30 минут для уничтожения неспороносных микробов.

68. Обе колбы с посевом (пастеризованным и непастеризованным) ставят в термостат при 37°.

69. Через 8 - 14 дней из среды обогащения производят высев в агар столбиком либо на чашках с сахарным кровяным агаром и в дальнейшем изучают биологические и антигенные свойства выделенных культур по методу выделения культур анаэробов.

70. Для обнаружения токсина пользуются биологической пробой. Испытуемую жидкость в количестве 0,5 мл впрыскивают 2-3 мышам под кожу или внутримышечно.

71. В качестве контроля 2-3 мышам вводят прогретою испытуемую жидкость, а также другим 2-3 мышам вводят непрогретую жидкость в смеси с антиботулинистической поливалентной сывороткой.

72. Если мыши, которым ввели непрогретую испытуемую жидкость погибают через 1 - 4 суток, а контрольные мыши остаются живыми, то биологическая проба на присутствие яда bac. botulinus считается положительной.

Главный государственный санитарный инспектор СССР

В. Жданов