Приложение. Приготовление растворов для исследования воды, почвы, смывов с объектов внешней среды на присутствие возбудителя сибирской язвы

Приложение
к Инструкции по исследованию воды,
почвы, смывов с объектов внешней
среды на присутствие возбудители
сибирской язвы

I. Обработка мембранных фильтров

Новые мембранные фильтры промывают сутки в проточной водопроводной воде, затем высушивают на фильтровальной бумаге, раскладывая по 1 штуке. Мембранные фильтры перед посевом стерилизуют кипячением в трижды сменяемой дистиллированной воде по 20-30 минут. В последней воде мембранные фильтры хранят до следующего употребления.

II. Среда ГКИ

Среду ГКИ (Государственный Контрольный Институт) готовят следующим образом: в стерильную колбу берут 60 мл раствора Хэнкса и добавляют (стерильно) 40 мл бычьей сыворотки, инактивированной при 56°С в течение 30 минут. После тщательного перемешивания РН среды доводят раствором соды до 7,2 и разливают по 2 мл в пробирки. Пробирки закрывают стерильными резиновыми пробками. Среда может храниться при температуре +4°С длительное время, не утрачивая своего качества.

Ill. Питательная среда для получения споровой культуры В. anthracis *

Среда казеинового перевара. рН - 7,2-7,4

Основой среды является триптический перевар казеина, к которому добавляют разбавленный водяной экстракт дрожжей и различные соли, играющие важную роль в питательных потребностях бациллы сибирской язвы.

На этой среде получают спорообразование в 90-95%.

Рецепт приготовления казеинового перевара

Состав среды:	Казеин		200,0 г
	Натрий углекислый кристаллический	-	20.0 "
	Суспензия размолотой поджелудочной железы	-	100,0 г
	Xлороформ	-	10,0 мл
	Вода	-	2000,0 "

Изготовление суспензии поджелудочной железы

С трех килограммов поджелудочной железы удаляют жир. Затем ее тонко размалывают, взвешивают, помещают в бутыль, куда добавляют воду в количестве три раза большем ее веса, резко встряхивают и добавляют алкоголь до 25%. Перед употреблением тщательно взбалтывают.

Приготовление казеинового перевара

Казеин и углекислую соду помещают в колбу или бутыль и добавляют двумя порциями воду, подогретую до 37°С, после каждого добавления воды содержимое бутыли хорошо взбалтывают, затем добавляют суспензию размолотой поджелудочной железы и хлороформ, хорошо выбалтывают. Устанавливают рН = 7,4-7,5. Помещают в термостат на 16 дней при температуре 37° и ежедневном взбалтывании. Ежедневно берут образцы и устанавливают рН = 7,4-7,5. После удаления из термостата среда отстаивается два дня и отфильтровывают кристаллы тирозина, которые остаются в виде белого осадка.

К двум литрам фильтрата добавляют 15 мл концентрированной соляной кислоты, растворенной в 150 мл воды и кипятят 60 минут. Охладить, профильтровать и установить реакцию до рН = 7,4 (требуется 6-7 мл 40% раствора NaOH). Поместить в колбу или бутыль, добавить 1% хлороформа, быстро взболтать несколько раз, чтобы хлороформ эмульгировался и хранить и темном месте.

Водный экстракт дрожжей

Состав:	Пивных дрожжей	-	125 г
	Воды дистиллированной	-	1000 мл

Растворить дрожжи с водой в колбе и кипятить, непрерывно размешивая до прекращения пены; профильтровать на фильтре через пластинки. Добавить 1% хлороформа, хранить в колбах или бутылях в темноте, резко взбалтывая.

Для массового производства колбы ставят на ночь на холод. Утром прозрачный слой сифонируют в одну емкость, а затем фильтруют.

На изготовление одного литра среды берут:
Среды казеинового триптического перевара		-	50 мл
Водяного экстракта дрожжей		-	200 мл
7 +	Калия фосфорнокислого двузамещенного	-	5 г
6 +	Калия фосфорнокислого однозамещенного	-	1 г
5 +	Сернокислого натрия	-	0,3 г
4 +	Хлористого кальция	-	0,1 г
3 +	Сернокислого марганца	-	0,03 г
2 +	Сернокислой магнезии	-	0,05 г
1 +	Сернокислого железа	-	0,01 г
	Агара	-	30,0 г
	Воды дистиллированной до	-	1000,0 мл

Примечания: 1. Взамен дрожжевого экстракта можно использовать 0,5% раствор дрожжей "Бакто"

2. Соли, отмеченные знаком + могут быть опущены.

3. Арабские цифры от 7 до 1 обозначают порядок растворения солей.

4. Натрии фосфорнокислый не следует использовать взамен солей калия.

Среду с помощью фосфатного буфера доводят до рН = 7,2.

Заместитель начальника Главного санитарно-эпидемиологического управления Министерства здравоохранения СССР

Г. Николаевский

______________________________

*Среда может быть заказана в ИЭМ имени Н.Ф. Гамалеи.