Приложение 2. Рецептура рекомендуемых консервирующих смесей, питательных сред и индикаторов

Приложение 2

Рецептура рекомендуемых консервирующих смесей, питательных сред и индикаторов

1. Консерванты

Глицериновая смесь. К 1 л физиологического раствора добавляют 0,5 л химически чистого нейтрального глицерина и устанавливают рН среды, равный 8,0, добавляя 20% фосфорнокислого натрия ().

Стерилизуют при температуре 112° в течение 15 минут. После стерилизации рН должен быть равен 7,6-7,8.

Желчный бульон. К 800 мл бульона добавляют 200 мл нативной бычьей желчи; рН готового консерванта равен 7,6.

Стерилизуют текучим паром 2 раза по 30 минут.

2. Дифференциальные питательные среды

Среда Плоскирева*. Среду готовят по прописи, указанной на этикетке.

Каждую новую серию сухой элективной питательной среды следует проверять при помощи посевов на нее специально зараженных фекалий или дизентерийных культур Зонне и Флекснера.

Если среда работает правильно, при посеве на чашку 0,05 мл физиологического раствора, содержащих 100 микробных клеток бактерий Флекснера и 10 000 клеток кишечной палочки, через 24 часа инкубации при температуре 37° вырастают единичные брусничного цвета колонии кишечной палочки и единичные прозрачные бесцветные колонии шигелл Флекснера.

При полном отсутствии роста кишечной палочки и значительном угнетении роста патогенных бактерий уменьшают количество порошка на 0,5-2 г на 100 мл среды и заменяют его таким же количеством сухого питательного агара.

При слишком обильном росте кишечной палочки навеску порошка на 100 мл среды увеличивают на 0,5-1 г.

Среда Ресселя из сухих питательных сред. На 950 мл дистилированной воды берут 40 г сухого питательного агара с лактозой и индикатором ВР и 5 г питательного агара. Смесь растворяют при нагревании до кипения. Затем в 50 мл дистилированной воды растворяют 1 г химически чистой глюкозы и добавляют к приготовленной смеси.

Разливают в стерильные пробирки по 5-6 мл и стерилизуют текучим паром 2 раза по 30 минут. Среду скашивают так, чтобы остался небольшой столбик (не менее 3 см высотой).

Среду с маннитом и сахарозой готовят по тому же принципу: на 950 мл дистиллированной воды берут 40 г сухого питательного агара с сахарозой и индикатором ВР и прибавляют 1 г маннита, растворенного в 50 мл дистиллированной воды.

Цвет среды серовато-розовый, при кислотообразовании меняется на синий.

Среда "скошенный столбик" из сухих питательных сред. В 100 мл горячей стерильной дистиллированной воды растворяют 4 г сухой среды с лактозой и индикатором ВР, 0,1 г глюкозы и 1 г мочевины.

Полученный раствор разливают в стерильные пробирки и стерилизуют текучим паром в течение 15 минут.

Среду скашивают, как среду Ресселя. Цвет среды серовато-розовый. При кислой реакции цвет среды меняется на синий, при щелочной - на оранжевый.

Среда Асель-Либермана. На 1 л агаровой среды добавляют 10 г лактозы и 0,6 г конго красного.

Агар, содержащий 1% лактозы, стерилизуют 2 раза текучим паром. Среду можно приготавливать впрок и длительно хранить в лаборатории.

Перед употреблением в среду добавляют конго красный. Краситель предварительно растворяют в пробирке с 3-4 мл дистиллированной воды при подогревании над пламенем горелки (не кипятить).

3. Среды обогащения

Селенитовая среда. Основным действующим началом этой среды является кислый селенистокислый натрий, который, с одной стороны, стимулирует рост патогенных бактерий (будучи взятым в строго определенной концентрации), а с другой - подавляет рост сопутствующей флоры.

Состав среды:

натрий кислый селенистокислый (без примеси теллура) - 4 г;

пептон** - 5 г;

натрий фосфорнокислый двузамещенный безводный - 7 г;

натрий фосфорнокислый однозамещенный - 3 г;

лактоза (химическая чистая) - 4 г;

дистиллированная вода - 1000 г.

Приготовление среды. Среду готовят из двух основных растворов. Сначала экспериментально определяют точную пропорцию и , которая с используемым образцом пептона и кислого селенистокислого натрия давала бы рН не выше 7,0 (6,9-7,1), что регулируется изменением соотношения фосфатов. Такую предварительную подтитровку необходимо делать всякий раз, когда меняется серия любого из входящих в среду основных ингредиентов (пептон, кислый селенистокислый натрий, фосфаты).

Когда такое соотношение установлено, к приготовленному раствору фосфатов добавляют пептон и лактозу.

Разливают во флаконы по 50 мл и стерилизуют текучим паром в течение 2 дней по 30 минут или при температуре 112° в течение 30 минут.

Отдельно на стерильной дистиллированной воде готовят 10% раствор кислого селенистокислого натрия. Перед началом работы на каждый флакон с 50 мл основного раствора добавляют 2 мл раствора кислого селенистокислого натрия.

Приготовленную среду разливают в стерильные пробирки по 5-7 мл и закрывают плотно пригнанными пробками.

Стерилизация в автоклаве готовой среды по допускается, так как при этом происходит редукция селенита натрия, выпадает красный осадок и среда становится непригодной.

Основной раствор среды может храниться в холодильнике в течение 1-2 месяцев.

Испражнения вносят и пробирки со средой в таком количестве, чтобы по отношению к среде они составили примерно 1/5, перемешивают и помещают на 18-20 часов в термостат, после чего делают высев на чашки со средой Плоскирева.

При использовании селенитовой среды для исследования мочи, рвотных масс или промывных вод среду следует готовить с удвоенной концентрацией входящих в нее составных элементов и исследуемый материал засевать в соотношении к среде 1:1.

Примечания. 1. Раствор кислого селенистокислого натрия готовят ex tempore.

2. Если для приготовления среды употребляют фосфаты с кристаллизационной водой, то соотношение их соответственно должно быть изменено.

Среда Мюллера. В стерильные флаконы отвешивают по 4,5 г мела, стерилизуют сухим жаром. Наливают в каждый флакон по 90 мл бульона и стерилизуют при 1 атм в течение 30 минут. В асептических условиях ex tempore добавляют 2 мл раствора Люголя и 10 мл раствора серноватистокислого натрия .

Для приготовления среды Мюллера используют бульон из перевара Хоттингера, содержащий 130-150 мг% аминного азота. Очень важное значение имеет также рН среды. В связи с тем что некоторые сорта мела вызывают довольно значительные изменения рН бульона после автоклавирования, следует обязательно проверять реакцию каждой новой партии среды после стерилизации для установления рН = 7,2-7,4. С этой целью достаточно произвести проверку в одном из флаконов и определить необходимый для подтитровки данного количества среды объем кислоты (или щелочи).

Раствор Люголя: 100 мл дистиллированной воды, 20 г йодистого калия и 25 г йода.

Раствор серноватистокислого натрия: в измерительный цилиндр насыпают 50 г серноватистокислого натрия и добавляют дистиллированной воды до 100 мл. Переливают в бутыль.

Стерилизуют текучим паром.

Среда Кауфмана. К 500 мл стерильной среды Мюллера добавляют 25 мл стерильной бычьей желчи и 5 мл 0,1% водного раствора бриллиантового зеленого. Разливают в стерильные пробирки.

Среда Раппопорт. К 1 л бульона с 10% бычьей желчи добавляют 2% глюкозы и в качестве индикатора 1% раствора Андредэ или 0,1% спиртового раствора бромкрезолпурпурного. Разливают по 50 мл во флаконы, куда вкладывают поплавок.

Стерилизуют текучим паром в течение 3 дней по 30 минут.

4. Дополнительные дифференциальные среды для идентификации шигелл и сальмонелл

Синтетическая лакмусовая сыворотка (лакмусмольке). Для приготовления синтетической лакмусовой сыворотки следует в 1 л дистиллированной воды растворить:

пептона лучшего качества	0,05 г
хлористого натрия (химически чистого)	5 г
лимоннокислого аммония	2 г
сернокислого аммония	1 г
фосфорнокислого натрия двузамещенного	0,5 г
глюкозы (химически чистой)	0,4 г
лактозы (химически чистой)	20 г
азолитмина	0,3 г

(азолитмин можно заменить настойкой лакмуса, добавив 1-2% хорошо окрашенного раствора).

Азолитмин плохо растворим, для улучшения его растворимости крупные кристаллы азолитмина предварительно растирают в ступке, затем растворяют при кипячении в течение 10 минут. К растворенному азолитмину добавляют остальные компоненты. Недостаточное растворение азолитмина может служить причиной плохой работы среды.

Среду разливают в стерильные пробирки по 1,5-2 мл и стерилизуют однократно текучим паром в течение 30 минут.

Цвет среды фиолетовый. При образовании кислоты меняется на розовый, при щелочеобразовании среда синеет.

Приготовление настойки лакмуса. В ступке тщательно растирают 10 г лакмуса в кусках, заливают 50 мл 96° спирта и ставят в термостат на сутки.

На 2-й день спиртовую вытяжку сливают в отдельный флакон, осадок опять заливают 96° спиртом и снова ставят в термостат на сутки.

На 3-й день сливают вторую спиртовую вытяжку и присоединяют к первой порции, а осадок заливают 50 мл дистиллированной воды и ставят на сутки в термостат. На 4-й день процедуру повторяют. На 5-й день первую и вторую водные вытяжки присоединяют к спиртовым. Смесь фильтруют через бумажный фильтр и слегка подкисляют до фиолетового цвета. Можно добавить несколько капель хлороформа.

Цитратная среда Кристенсена

Лимоннокислый натрий	3 г
Глюкоза	0,2 г
Дрожжевой экстракт	22 мл
Цистин солянокислый	0,1 г
Фосфорнокислый калий однозамещенный	1 г
Хлористый натрий	5 г
Феноловый красный 0,4% водный раствор	3 мл
Агар-агар	15 г
Дистиллированная вода	1000 мл

рН среды не устанавливается, среду стерилизуют в течение 15 минут при 1 атм.

Для приготовления среды все соли предварительно растворяют в малых количествах воды. Затем соединяют с агаром, оставляют до набухания агара. Состав кипятят до полного растворения агара, фильтруют и добавляют 0,4% водный раствор фенолового красного (3 мл на 1 л среды). При щелочеобразовании среда краснеет.

Приготовление дрожжевого экстракта для среды Кристенсена. В 1 л воды растворяют 500 г хлебных дрожжей, кипятят в течение 1 часа, после чего фильтруют через бумажный фильтр. Стерилизуют в течение 30 минут при 0,5 атм. Добавляют 22 мл экстракта на 1 л среды Кристенсена.

Бульон с мочевиной. К 100 мл мясопептонного или хоттингеровского бульона (рН строго равен 7,0) добавляют 1 г мочевины и 0,2 мл 1,6% спиртового раствора крезолового красного. Разливают в стерильные пробирки по 2-3 мл. Стерилизуют текучим паром в течение 10-15 минут. Цвет среды желтый. При расщеплении мочевины среда краснеет.

Среда для посева по Свену Гарду. Бульон мясопептонный или на переваре Хоттингера - 100 мл. Агар-агр 0,5-0,8%.

Отмытый и отжатый агар-агар добавляют в бульон, кипятят до расплавления агар-агара, проверяют рН (7,2-7,4).

Фильтруют через бумажный фильтр, разливают в стерильные большие пробирки по 20 мл. Стерилизуют при 1 атм в течение 30 минут.

Молоко. Свежее молоко доводят на огне до кипения, оставляют в прохладном месте на сутки. Снимают верхний жирный слой. Вторично кипятят, оставляют еще на сутки, опять снимают верхний слой.

Разливают по 2-3 мл. Стерилизуют текучим паром и течение 2 дней по 30 минут.

Среда с повышенным содержанием лактозы

Вода дистиллированная	100 мл
Пептон	0,5%
Хлористый натрий	0,5%
Реактив Андредэ	1%
Лактоза	4%

Стерилизуют при 0,5 атм в течение 20 минут, лучше текучим паром 3 дня подряд по 20 минут.

При разложении лактозы среда краснеет.

Среда с глицерином

Вода дистиллированная	100 мл
Пептон	1%
Хлористый натрий	0,5%
Реактив Андредэ	1%
Агар-агар	0,5%
Глицерин	2%

Стерилизуют текучим паром в течение 20 минут.

При расщеплении глицерина среда краснеет.

Приготовление индикаторных бумажек

а) На индол

Смешивают:
парадиметиламидобензальдегид	3-5 г
спирт 96°	50 мл
фосфорную кислоту (очищенную концентрированную)	10 мл

Затем дают раствориться порошку. Полученной тепловатой жидкостью смачивают полоски фильтровальной бумаги, высушивают и нарезают узкими полосками.

Цвет бумажки желтый. При наличии индола цвет бумажки меняется - от сиренево-розового до интенсивно-малинового. Появление других цветов на индикаторной бумажке не учитывают.

б) На сероводород

Лист фильтровальной бумаги смачивают в следующем растворе:

дистиллированной воды	100 мл
уксуснокислого свинца	20 мл
двууглекислой соды	1 г

Бумагу высушивают, нарезают полосками. После обработки бумага остается белой, при наличии сероводорода чернеет.

______________________________

* Изготовляется Дагестанским институтом питательных сред в сухом виде.

** Для приготовления этой среды пригодны: чешский пептон фирмы Спофа или венгерский - фирмы Рихтер, а также пептон из бычьего сердца, приготовленный по рецепту Московского НИИВС имени Мечникова.