Инструкция по применению серологических методов диагностики при эпизоотологическом обследовании природных очагов чумы (утв. Министерством здравоохранения СССР 4 июня 1974 г.)

Введение

Методы серологической диагностики (выявление капсульного антигена чумного микроба и антител к нему) в настоящее время относятся наравне с бактериологическими к числу основных приемов исследования на чуму.

В инструкции рассматриваются вопросы применения серологических реакций, основанных на феномене пассивной (непрямой) гемагглютинации. В качестве диагностикумов в этих реакциях используют эритроциты барана, на которых адсорбирован либо специфический капсульный антиген (фракция I) чумного микроба, либо гамма-глобулин чумной агглютинирующей сыворотки (антитела).

Первый отечественный опыт использования реакции пассивной гемагглютинации (РПГА), а также предложенной советскими исследователями реакции нейтрализации антител (РНАт) в практике эпизоотологического обследования природных очагов чумы был обобщен в 1962 г. в инструктивных материалах Ростовского противочумного института.

Дальнейшее совершенствование методик, разработка Ростовским противочумным институтом принципиально новой высокочувствительной реакции нейтрализации антигена (РНАг) и эритроцитарного антительного диагностикума, создание Среднеазиатским противочумным институтом необходимой документации и производственной базы, наконец, освоение серийного изготовления этого диагностикума обеспечили широкое использование серологических методов при эпизоотологическом обследовании.

Очевидной стала необходимость в выпуске нового документа, в котором излагались бы все методы серологического исследования на чуму и были регламентированы приемы их использования. Таким документом явилось изданное Среднеазиатским противочумным институтом в 1968 г. "Руководство по применению серологических методов исследования при диагностике чумы в природных очагах СССР". Серологическое исследование, примененное параллельно с бактериологическим, позволяет получить из поступающего материала существенную дополнительную информацию и тем самым делает эпизоотологическое обследование более полноценным.

Серологические методы весьма эффективны при решении таких практических задач, как поиск мест циркуляции возбудителя чумы в популяциях грызунов во все фазы эпизоотии, определение тенденции ее развития и прогнозирование эпизоотической обстановки на конкретных территориях, уточнение границ зараженных участков, наблюдение за движением эпизоотии по территории и выяснение преемственной связи соседних участков, оценка противоэпизоотической эффективности борьбы с носителями и переносчиками. Особо следует отметить высокую результативность серологических методов при исследовании трупов верблюдов, быстро загнивающих в условиях жаркого климата пустынных очагов чумы.

Важное значение имеют эти методы для выявления антител у людей, привитых против чумы, для косвенного определения иммунологической перестройки их организма.

Известны два направления в серологических исследованиях: первое - поиск антител к фракции I чумного микроба у животных - носителей чумы, а также у привитых людей и животных, второе - поиск специфического чумного антигена (фракции I) в организме теплокровных животных, в эктопаразитах и некоторых объектах внешней среды*.

Для выявления антител применяют реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА), в которой используют эритроциты барана с адсорбированной на них фракцией I (диагностикум чумной эритроцитарный антигенный), и реакцию нейтрализации антигена (РНАг), в которой диагностикумом служат эритроциты барана, сенсибилизированные гамма-глобулином чумной агглютинирующей сыворотки (диагностикум чумной эритроцитарный антительный).

Для выявления фракции I чумного микроба применяют реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА) с антительным диагностикумом и реакцию нейтрализации антител (РНАт), в которой используют антигенный диагностикум.

Необходимо отметить, что описываемые в инструкции методы серологического исследования с использованием названных диагностикумов эффективны при условии циркуляции в природном очаге полноценных в отношении антигенного состава штаммов чумного микроба, однако они не пригодны для диагностики атипичных вариантов микроба, лишенных капсульного антигена (фракции 1).

В настоящее время серологические методы внедрены в практику эпизоотологического обследования еще не во всех природных очагах чумы СССР. Для некоторых очагов пока не разработаны тактические и методические приемы их использования, в связи с чем в инструкции отсутствуют конкретные рекомендации для таких территорий. Не включены в инструкцию некоторые новые приемы исследований, находящиеся пока в стадии разработки или испытаний.

Режим работы при серологических исследованиях

При проведении серологических исследований на чуму на всех этапах до момента полного обеззараживания материала необходимо строго руководствоваться положениями "Инструкции по режиму работы с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность возбудителем чумы...", утвержденной Министерством здравоохранения СССР 21 июня 1967 г.

Серологическое исследование является частью общего лабораторного исследования на чуму. Оно должно проводиться в помещениях бактериологических лабораторий эпидотрядов, противочумных отделений и станции или в других, соответствующим образом приспособленных местных помещениях, палатках, вагонах-лабораториях, автолабораториях. Исследование обеззараженного материала может проводиться в чистом (не заразном) блоке лабораторий. Поступающий на серологическое исследование материал подлежит обязательной регистрации в журнале.

К подготовке и квалификации работников, осуществляющих начальные этапы серологического исследования до момента полного обеззараживания материала, предъявляются такие же требования, как и к тем, кто проводит бактериологические исследования зараженного или подозрительного на зараженность возбудителем чумы материала. На работников серологических групп (лабораторий) распространяются все требования режима в отношении допуска к работе, вакцинации, наблюдения за состоянием здоровья, изоляции и специфического лечения в случае аварии или заболевания.

Особенно строгими должны быть требования к режиму работы при серологических исследованиях с целью поиска в материале фракции I чумного микроба. Таким материалом может быть пунктат и кровь, взятые у человека или верблюда при подозрении на заболевание их чумой. Не меньшую опасность представляют кровь и суспензии органов экспериментальных животных, зараженных возбудителем чумы, кровь суспензии органов и костного мозга трупов диких грызунов, хищников или верблюдов, найденных в поле, суспензии органов грызунов с патолого-анатомическими изменениями, взвеси культур чумного микроба.

При подготовке к серологическому исследованию на наличие фракции I любого материала из приведенного выше перечня его обеззараживают формалином. В бактериальные взвеси добавляют формалин до 4%, после чего их выдерживают в течение 1 часа. В суспензии органов, в пунктат и кровь формалин добавляют до 1-2% содержания, после чего материал выдерживают не менее 12 часов.

Бактерицидное действие используемого формалина в указанных концентрациях должно быть проверено до начала работ путем контрольных посевов обработанного формалином заведомо зараженного материала и инкубирования посевов в течение 48 часов. Для работы можно применять формалин, обеспечивающий безусловное обеззараживание материала. Контроль этот периодически повторяют.

При необходимости срочного диагноза материал (суспензии органов и бактериальные взвеси в физиологическом растворе) обеззараживают кипячением в течение 5 минут и исследуют затем в РНАт.

При подготовке сывороток или суспензий крови (смывов) к исследованию на наличие антител их обеззараживают путем добавления мертиолята натрия до разведения 1:10000 и последующего прогревания при 56° в течение 30 минут. Такое комбинированное воздействие мертиолята натрия и прогревания строго обязательно. В этом случае достигается полное обеззараживание материала.

После обработки материала указанными способами все последующие манипуляции с ним (в том числе и постановку реакций) проводят как с незаразным материалом в костюме IV типа.

Не требует обеззараживания кровь (сыворотка), взятая у людей или животных после вакцинации их чумными вакцинами, утвержденными соответствующими инструкциями Министерства здравоохранения СССР.

Все используемые непосредственно при постановке реакций инструменты и посуда, в частности полистироловые пластинки, не требуют специальной обработки какими-либо дезрастворами. Шприцы, пипетки кипятят и тщательно моют с целью удаления возможных остатков веществ (антигена, сыворотки). Полистироловые пластинки моют чистой водой. Периодически с целью обезжиривания их обрабатывают 96°-ным спиртом. Пробирки с остатками материала моют после кипячения в мыльном растворе.

В исключительных случаях, когда возникает необходимость серологического исследования необеззараженного материала, вся работа должна осуществляться с соблюдением соответствующих требований режима. Серологические реакции в этих случаях разрешается ставить только в бактериологических пробирках (с круглым дном), а не в полистироловых пластинках. Все инструменты и посуда в таких случаях подлежат обязательному обеззараживанию.

______________________________

* Рекомендации по серологическому исследованию эктопаразитов и таких объектов внешней среды, как погадки хищных птиц, субстрат гнездовой камеры грызунов и др., были впервые даны во "Временном наставлении по эпизоотологическому обследованию в природных очагах чумы Кавказа", Ставрополь, 1971.

** Выпускается также под названиями "Тиомерсаль" и "Тимерозаль".

*** После титрования каждой сыворотки шприц промывают 3-5 раз свежими порциями физиологического раствора (пипетку заменяют).

Приложения

Пояснительная записка

Форма 1. Программа-задание на очередной день работы. Составляется после того, как учтены результаты предыдущей постановки реакций. Составление такой программы, особенно по разделу "Перестановка", облегчает размещение реакций на пластинках, уменьшает вероятность пропуска, позволяет рассчитать дневную потребность в рабочих растворах и других ингредиентах.

Форма 2. Протокол серологического исследования животных заполняется за каждый день. При учете результатов первичного (отборочного) исследования в протокол вносят только положительные ответы. Результаты реакций записывают значками. В тех случаях, когда уже в первичной постановке определяется титр, его записывают также цифрами. Результаты перестановки реакций в развернутом ряду и постановки реакций на наличие антигена записывают под отдельными рубриками.

Форма 3. В журнал вносят всех исследованных животных, независимо от полученного результата. Это позволяет вести общий учет исследованных животных. Рекомендуется конечные результаты (титр реакций) вносить также в журнал вскрытия грызунов.

Аналогичный журнал ведут для регистрации результатов исследования материала на наличие антигена.

Форма 4. Заполняется отдельно для каждого вида грызунов. Полученные данные суммируются для каждого участка и каждого срока обследования отдельно.

Форма 1

Задание на 5 июня 1973 г. (пример)

1. Первичная (отборочная) постановка с N 1775 по N 1814.

2. Перестановка

РПГА на 8 лунок
РНАг на 8 лунок		РНАг на 8 лунок
N 1736		N 1755
1738		1767
1748

3. РПГА с антительным диагностикумом на 12 лунок N 199 - суспензия органов биопробы

4. РНАт на 12 лунок

N 7 - кости большой песчанки

5. Адсорбировать 50%-ной взвесью эритроцитов сыворотки N 1751 и N 1753, после чего поставить:

РПГА на 3 лунки		РПГА на 8 лунок
РНАг на 3 лунки		РНАг на 8 лунок
N 1751		N 1753

Форма 2

ПРОТОКОЛ
серологического исследования животных (пример)
Постановка 5 июня 1973 г. с N 1775 по N 1814

N по журналу вскрытия	Материал (сыворотка, смыв и др.)	Результат					Дальнейшая обработка
		РПГА (с 1:20)			РНАг (с 1:20)		адсорбиров. 50% взвесью эритроцитов	развернуть (на ск. лунок)
								РПГА	РНАг
1785	смыв	+ + +			- - -		-	8	8
1786	"	+ _ -		1:20	- - _	1:40	-	-	-
1788	"	+ _ -		1:20	- - -		-	-	8
1789	"	+ + +			- - -		-	8	8
1791	"	+ + +			- - -		-	8	8
1795	"	+ + _		1:40	- -	1:40	-	-	-
1798	"	+ + +			+ -		адсор.	8	8
1804	"	- - -		0	- +	1:20	-	-	-
Перестановка реакций за 4 июня 1973 г.
1736	смыв	+ + + _ - -			- - - - - +
		1:80			1 :320		-	-	-
1738	"	+ + + + _ -			- - - - - - -
				1:160	+	1:1280	-	-	-
1748	"	+ + + + + +			- - - - - - - -		-	-	12
		-		1:640
1755	"				- - - - - - -
					+	1:1280	-	-	-
1767	"				- - - - + +
					1:160		-	-	-

	Контроль раствора антигена для РНАг + + - (2ГЕ)
N 199	РПГА с антительным диагностикумом (сусп. орг. биопробы) ++++++++ - - -
N 7	РНАт (кости большой песчанки) - - - - - +

Форма 3

ЖУРНАЛ
серологического исследования животных на наличие антител (пример)

N по журналу вскрытия	Вид животного	Материал	Дата исследования	Результат
				РПГА (с 1:20)		PHAг (c 1:20)
1782	Большая песчанка	смыв	5/VI	- - -		+ + +
1783	"	"	"	- - -		+ + +
1784	"	"	"	- - -		+ + +
1785	"	"	5/VI	+ + +		- - -
		"	6/VI	+ + + + +		- - - - - -
				- 1:320		-	1:1280
1786	"	"	5/VI	+ -	1:20	- -	1:40
1787	"	"	5/VI	- - -		+ + +
1788	"	"	5/VI	+ -	1:20	- - -
			6/VI			- - - - - -
						+	1:640
1789	"	"	5/VI	+ + +		- - -
			6/VI	+ + + + -		- - - - - -
				1:160		- -
			7/VI			- - - - - -
						- - -
						1:5120
1790	"	"	5/VI	- - -		+ + +
1791	"	"	5/VI	+ + +		- - -
			6/VI	+ + + -		- - - - -
				1:80		+	1:320
1792	Полуденная песчанка	"	5/VI	- - -		+ + +
1793	"	"	"	- - -		+ + +
1794	Малый тушканчик	"	"	- - -		+ + +
1795	Хорь степной	"	5/VI	+ + 1:40		- -	1:40

Форма 4

Первичная обработка результатов серологического исследования грызунов (пример)

N по журналу вскрытия	Титр		Превышение титра РНАг (во сколько раз)	Название участка и дата обследования
	РПГА	РНАг
1577	1:10240	1:20480	2	Окр. пос. Сарыташ. 3/VI-1973 г.
1578	1:160	1:1280	8	"
1579	1:40	1:1280	32	"
1583	1:40	1:640	16	"
1586	1:640	1:5120	8	"
1587	1:20	1:80	4	"
1588	1:80	1:1280	16	"
1589	1:320	1:1280	4	"
1591	1:20	1:640	32	"
1596	1:40	1:40	равны	"
1597	1:20	1:80	4	"
1599	1:320	1:1280	4	"
1601	1:40	1:1280	32	"
1602	1:20	1:80	4	"

Таблица

Пример эпизоотологического анализа результатов серологического исследования больших песчанок*

N участка	Название участка и дата обследования	Всего исследовано животных	Всего положительных				Число случаев с превышением титра РНАг над титром РПГА (во сколько раз)					Число случаев положительных только в РНАг с тит.		Средний геометрический тигр
			РПГА		РНАг
			абс.	%	абс.	%	титры равны	2	4	8	16 и более	1:20 - 1:40	1:80 и выше	РПГА**	РНАг
Эпизоотия прекратилась давно (3-4 месяца назад и более), или в этот же срок резко снизилась ее интенсивность
1	Даныспан 29/IV-1971 г.	49	18	37	26	53	10	8	0	0	0	8	0	1:49	1:49
Эпизоотия возникла давно и в последний период протекает с малой интенсивностью
2	Бескемпыр 18/V-1971 г.	95	38	40	48	62	18	15	2	1	2	9	1	1:61	1:80
Эпизоотия возникла давно и в последний период протекает интенсивно
3	Есекжар 26/IХ-1970 г.	73	29	40	49	67	8	8	7	4	2	12	8	1:70	1:98
Эпизоотия возникла (обострилась) недавно
4	Аякшорым 29/V-1971 г.	62	5	8	10	16	0	1	0	1	3	0	5	1:25	1:368

______________________________

* В таблице приведены фактические данные обследования одного из районов Среднеазиатского равнинного очага чумы.

** Средний геометрический титр антител в РПГА вычисляется только для положительно реагировавших в данной реакции животных.

Начальник Главного управления карантинных инфекций Министерства здравоохранения СССР

И.Д. Ладный