Откройте актуальную версию документа прямо сейчас
Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.
Раздел I
Применение серологических методов при эпизоотологическом обследовании
Тактика применения серологических методов при эпизоотологическом обследовании (основные принципы)
В практике обследовательских работ в настоящее время более широко используются методы серологического исследования, предназначенные для поиска антител к фракции I чумного микроба.
Тактические приемы и эффективность применения этих методов не одинаковы при эпизоотологическом обследовании природных очагов чумы разного типа и в разные фазы их эпизоотической активности. Результативность исследования прежде всего зависит от восприимчивости и чувствительности носителей к чумному микробу и их способности к выработке антител. Опыт работы в природных очагах чумы и результаты лабораторных экспериментов показали высокую эффективность серологического исследования больших и полуденных песчанок, краснохвостых песчанок из географических популяций, обитающих в Среднеазиатском пустынном очаге чумы, малых, желтых, даурских и длиннохвостых сусликов, сурков, монгольских пищух и арчевых полевок, а также хищников из семейства куньих. Экспериментально доказана способность некоторых видов птиц из отряда воробьиных, особенно каменки-плясуньи, заражаться чумой и вырабатывать антитела к капсульному антигену чумного микроба.
Исходя из существа определения понятия основного носителя чумы, можно предполагать высокую эффективность серологического исследования основных носителей в любом природном очаге чумы. Неодинаковой должна быть лишь тактика применения серологических методов, которая определяется эпизоотологическими закономерностями, присущими данному очагу, и прежде всего особенностями сезонной и многолетней динамики его эпизоотической активности. В обследовательских работах серологическое исследование применяют, как правило, параллельно с бактериологическим и эффективность его оценивают путем сравнения с результатами бактериологического исследования. В отдельных случаях возможно применение только серологического метода - например, при исследовании на наличие фракции I погадок хищных птиц, трупов животных, костных остатков и т.д. Но так или иначе положительные результаты серологического анализа влекут за собой необходимость применения бактериологического исследования полевого материала на данной территории.
Накопленный в противочумных учреждениях опыт применения серологических методов с целью поиска мест циркуляции чумного микроба в природных очагах, где основными носителями чумы являются зимоспящие грызуны (малый суслик, серый сурок), свидетельствует о более высокой эффективности серологических исследований и, значит, большей целесообразности их применения в весенние и раннелетние месяцы (предэпизоотический период) и в конце лета - начале осени в период затухания эпизоотий накануне залегания грызунов в спячку. Напротив, в середине лета, в сезон интенсивного течения эпизоотий среди сусликов и сурков серологическое исследование как прием поиска эпизоотических участков уступает в эффективности бактериологическому в связи с резко возрастающей частотой обнаружения зараженных грызунов.
Серологическое исследование не залегающих в спячку песчанок практически эффективно в течение всего года, однако и в очагах с этими видами носителей преимущество серологических методов исследования наиболее ощутимо в межэпизоотические сезоны, когда число зараженных животных в природе резко сокращается.
В межэпизоотический период, когда в течение ряда лет циркуляция возбудителя происходит крайне замедленно, серологическое исследование более результативно, чем бактериологическое, и потому его целесообразно проводить в этот период во всех природных очагах чумы и во все сезоны года.
Все сказанное характеризует серологические методы в качестве тактического приема поиска мест циркуляции возбудителя чумы в природе, т.е. эпизоотических участков.
Серологическое исследование второстепенных носителей во всех очагах следует проводить постоянно. Получаемая при этом дополнительная информация об их участии в эпизоотиях позволяет более определенно решать вопрос о роли второстепенных носителей в природной очаговости чумы. Кроме того, эти сведения представляют практический интерес, помогая более рационально (целенаправленно) проводить профилактические мероприятия (имеется в виду оздоровление очагов). Особо следует подчеркнуть необходимость направленного вылова и серологического исследования второстепенных носителей в межэпизоотический период.
Поиск мест циркуляции возбудителя чумы в природных очагах является, как известно, первоочередной задачей эпизоотологического обследования. Возможности серологических методов исследования, их эффективность при решении этой задачи зависят от конкретной эпизоотической обстановки в очаге. Необходимо четко дифференцировать цели обследования. Например, целью обследования может быть выявление интенсивной разлитой эпизоотии, поиск локально протекающей эпизоотии или, наконец, поиск мест циркуляции чумного микроба в межэпизоотический период.
В тех случаях, когда решается задача обнаружения интенсивно протекающей эпизоотии, представляющей большую эпидемическую опасность, эффективность серологического и бактериологического исследований оказывается практически одинаковой, т.е. эпизоотические участки, как правило, легко обнаруживаются и тем, и другим методом. Высокая эффективность бактериологического анализа в этот период объясняется, во-первых, высоким процентом зараженных грызунов, во-вторых, тем, что исследованию подвергаются также блохи, которых обычно не исследуют серологическими методами (исключение составляют лишь холодные горные очаги чумы - см. ниже).
Как правило, при интенсивной эпизоотии уже в первой пробе материала, взятого из природы, удается обнаружить зараженные объекты. Однако одновременное серологическое исследование грызунов на наличие антител дает ценную дополнительную информацию, позволяя установить интенсивность вовлечения животных в эпизоотию и на основе этих данных определить тенденцию ее дальнейшего развития (см. раздел "Анализ и эпизоотологическая оценка результатов серологического исследования"). Таким образом, серологическое исследование в данном случае играет хотя и вспомогательную, но весьма важную роль.
При поиске локальных эпизоотий, протекающих с небольшой интенсивностью, складывается иное положение. В этих случаях вероятность обнаружения их с помощью бактериологического исследования нередко остается за пределами возможности обычных методов обследования. Серологическое же исследование в подобных ситуациях имеет постоянное преимущество, ибо количество зараженных грызунов и блох в природе, и без того небольшое, подвержено значительным и резким сезонным колебаниям, тогда как количество переболевших зверьков на эпизоотическом участке, в том числе и с антителами, накапливается и их можно относительно легко обнаружить. Такое положение, однако, не дает оснований ограничиваться только серологическим исследованием животных. Это было бы нерационально по ряду причин. Во-первых, из исследования в данном случае выпадает такой важный объект, как блохи. Во-вторых, при низкой интенсивности пассирования возбудителя и небольшой площади эпизоотических участков для успешного выявления последних потребуются, как правило, большие пробы материала, сбор которых сопряжен со значительными организационными трудностями. Поэтому неразумно было бы не исследовать пойманных грызунов и блох одновременно и бактериологическим методом, т.е. не использовать возможность получить большую информацию из уже добытого материала. Наконец, надо учитывать и то обстоятельство, что бактериологическое исследование лишь повторно взятых через некоторое время проб, как это нередко рекомендовалось, может оказаться безуспешным вследствие угасания эпизоотии на участке. Между тем в период малой активности очага именно выделение культуры чумного микроба имеет принципиальное значение.
Более обширная информация об эпизоотическом состоянии участка (очага), получаемая с помощью серологических методов, особенно полезна при исследовании эпизоотии в начальные и ранние этапы их развития, когда обычные приемы бактериологического исследования бывают, как правило, малоэффективными. Именно эта фаза эпизоотии представляет наибольший интерес для практики, поскольку главная цель эпизоотологического обследования состоит в том, чтобы предвидеть (прогнозировать) развитие интенсивной эпизоотии, представляющей эпидемическую опасность. В свою очередь такой прогноз позволяет заблаговременно провести необходимые защитные мероприятия.
В этом плане следует рассматривать вопрос о тактике применения серологического исследования животных в межэпизоотический период, когда возбудитель чумы сохраняется в локальных очажках и в крайне малом количестве. Возможность выявлять серологическими методами не только протекающую в данный момент эпизоотию, но и участки, где циркуляция микроба происходит в форме цепочки спорадических случаев с удлиненными промежутками между очередными заражениями грызунов (замедленное пассирование), делает эти методы незаменимыми при обследовании очага в межэпизоотический период. В подобных ситуациях время, в течение которого в природе есть зараженные грызуны, весьма непродолжительно, тогда как переболевшие зверьки сохраняют в крови антитела и могут быть выявлены чаще и на протяжении более длительного времени.
Частный случай представляет использование серологических методов при обследовании территорий, об эпизоотическом состоянии которых отсутствует какая-либо информация. Это могут быть участки энзоотичной территории, ранее вообще не подвергавшиеся обследованию, или районы, в обследовании которых имели место длительные перерывы, а также совершенно новые территории за пределами известного ареала чумы. Первичную дифференциацию таких территорий целесообразно провести на основании данных только серологического исследования и зоопаразитологического наблюдения. Такое обследование с использованием только серологического метода может быть проведено в любое время года, в том числе и в межэпизоотический сезон, что значительно облегчает организацию работ. Предпочтительнее, конечно, такое обследование осуществлять в сезоны протекания эпизоотий в популяциях грызунов, населяющих данную территорию.
Весьма перспективно использование серологических методов для оценки противоэпизоотической эффективности борьбы с носителями и переносчиками чумы. Применяя серологическое исследование с этой целью, следят за изменением процента грызунов с антителами, определяют наличие антител у молодых особей, родившихся после проведения борьбы, высоту титра антител и, наконец, соотношение титров РПГА и РНАг. На основании анализа всех этих показателей можно более определенно судить об оздоровительном эффекте работ. Так, например, если в повторно взятых (после проведения борьбы) пробах хотя бы у единичных грызунов будет обнаружен очень высокий титр антител (например, у больших песчанок выше 1:640) или титр РНАг будет значительно превышать титр РПГА (при условии использования диагностикумов с одинаковой или близкой чувствительностью), то это будет свидетельствовать о продолжающемся пассировании микроба чумы на участке. Об этом же будут говорить факты обнаружения у молодых зверьков, родившихся после проведения работ, чумных антител в высоких титрах (у больших песчанок 1:320 и выше). При таком анализе материалов должны быть выделены и исключены случаи трансплацентарной передачи антител потомству. Явление это весьма часто наблюдается у больших песчанок. Устанавливается оно путем одновременного исследования самки из той же норы и сопоставления величины титров антител у детенышей и самки (матери). Титр антител у молодых песчанок в случаях трансплацентарной передачи всегда ниже, чем у самки (матери), и обычно бывает невысоким. Особой оценки требуют случаи обнаружения у очень молодых зверьков, вышедших на поверхность не более месяца назад, высоких титров антител одновременно в РПГА и РНАг (1:320 и выше). Такие факты свидетельствуют прежде всего о недавнем контакте зверьков с возбудителем чумы и, вероятно, еще о том, что они родились от самки, ранее контактировавшей с чумным микробом.
Контрольные пробы материала для оценки противоэпизоотической эффективности работ следует брать в сезон, наиболее благоприятный для пассирования возбудителя в популяции данного вида животных.
Все более широкое распространение в практике эпизоотологического обследования получают методы, предназначенные для обнаружения в полевом материале специфического антигена (фракции I) чумного микроба. В последнее время значительно расширился круг объектов исследования, что открывает совершенно новые перспективы использования серологических методов.
Возможность исследования загнивших и мумифицированных трупов животных или их костных остатков, т.е. материала, не пригодного для бактериологического исследования, делает серологические методы в ряде случаев единственно возможным диагностическим приемом. Особую ценность имеют эти методы в тех случаях, когда требуется срочно получить результат исследования животных, являющихся объектами охотничьего промысла (зайцы, лисы, хори, сурки и др.), контакт с которыми может угрожать эпидосложнениями.
Все найденные в поле трупы грызунов и хищников подлежат обязательному серологическому исследованию на наличие чумного антигена. В ряде случаев такому же исследованию целесообразно подвергать трупы павших лабораторных животных (биопробы). Последнее особенно важно, когда имеет место загнивание трупа.
В последнее время разработаны и рекомендованы в практику методики серологического исследования на наличие специфического чумного антигена погадок хищных птиц, субстрата гнездовых камер грызунов, почвы нор. Исследование этих объектов дает не только материалы для ретроспективной оценки событий, но служит также наводящим приемом поиска эпизоотических участков и даже новых энзоотичных территорий. Существенное тактическое преимущество этих методических приемов состоит в том, что сбор материала можно проводить в любое время вне зависимости от сезонных и многолетних изменений активности эпизоотии. Для практики также важно отсутствие необходимости в немедленном (после сбора) серологическом исследовании материала. Это позволяет проводить подобные сборы при рекогносцировочных обследованиях малоизученных территорий и прежде всего отдаленных и труднодоступных районов. Особо надо отметить значение методических приемов исследования субстрата гнездовых камер и почвы из нор грызунов для изучения структуры природных очагов, в частности для выявления участков стойкого сохранения чумы. Именно в таких участках наиболее вероятно накопление и длительное сохранение специфического антигена чумного микроба во внешней среде. При исследовании погадок, субстрата гнезда и почвы предпочтительнее применять реакцию нейтрализации антител (РНАт).
Приемы обнаружения чумного антигена в блохах-переносчиках чумы как метод эпизоотологического обследования территории хорошо зарекомендовали себя в холодном климате горных очагов чумы (Центральный Кавказ, Закавказье, Горный Алтай), определяющем особые взаимоотношения чумного микроба и организма блохи. Кроме ускоренного получения результатов анализа, достоинством метода является еще то, что собранный материал можно хранить в законсервированном состоянии длительное время до исследования. Следовательно, и этот методический прием удобен при обследовании отдаленных и труднодоступных территорий, а также малоизученных районов.
В особых модификациях серологический метод может быть применен для исследования блох в условиях жаркого климата пустынных очагов чумы (см. ниже).
В комплексе методов эпизоотологического обследования энзоотичной территории особое место занимает исследование верблюдов. Это определяется важным эпидемиологическим значением последних. Серологическое исследование больных или павших верблюдов является в настоящее время обязательным диагностическим приемом. Серологическое исследование трупов верблюдов нередко оказывается единственным эффективным методом. Имеется достаточное количество экспериментальных и эпизоотологических данных, свидетельствующих в пользу применения серологических методов при необходимости срочного эпидемиологического расследования случаев заболевания или гибели верблюдов с подозрениями на чуму. Практикой подтверждена высокая эффективность выявления серологическими методами фракции 1 микроба чумы в трупах павших верблюдов. Диагноз чумы может быть установлен при исследовании остатков мяса, костей, шкуры, паренхиматозных органов. При исследовании сывороток крови верблюдов из энзоотичных по чуме районов в некоторых случаях удается обнаружить специфические антитела к чумному микробу, что свидетельствует о контакте животных с возбудителем. В эпидемиологическом отношении подобные сведения представляют большую ценность. При обнаружении у верблюдов чумных антител следует выяснить, не проводилась ли в данной местности противочумная вакцинация верблюдов.
Выбор схемы исследования при поиске чумных антител
Выбор предпочитаемой реакции и схемы исследования зависит от стоящей перед эпизоотологическим обследованием задачи.
Как уже было указано выше, специфические антитела к фракции I чумного микроба можно выявить как путем постановки двухкомпонентной реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с использованием антигенного диагностикума, так и при постановке трехкомпонентной реакции нейтрализации антигена (РНАг) с антительным диагностикумом. При этом надо учитывать такие важные аспекты исследования, как диагностическая ценность той или иной реакции, их чувствительность, трудоемкость.
Путем постановки РПГА в сыворотке крови выявляются только так называемые полные антитела, которые, связываясь с полноценным специфическим антигеном, адсорбированным на бараньих эритроцитах, дают эффект гемагглютинации. В этом заключается важнейшая черта серологической активности полных антител.
В отличие от этого путем постановки РНАг выявляются не только полные антитела, но и неполные, так называемые блокирующие антитела. Последние отличаются своеобразной серологической активностью - они вступают в связь со специфическим антигеном (блокируют, нейтрализуют его), но не способны вызывать явление гемагглютинации, поскольку они имеют, по-видимому, лишь один активный центр.
В связи с тем, что в РНАг выявляются как полные, так и неполные антитела, т.е. все антитела, связывающие антиген, в большинстве случаев титр антител в этой реакции бывает выше, чем в РПГА. Следует при этом учитывать, что в первые дни заболевания чумой у животных продуцируются неполные антитела и только позднее появляются полные. В поздние сроки у выздоровевших от чумы зверьков, а также в сыворотке крови неоднократно контактировавших с чумным микробом животных обычно выявляются лишь полные антитела.
По разнице в титрах антител в РПГА и РНАг можно судить о наличии или отсутствии в сыворотках неполных антител лишь при условии, что в исследовании были использованы серии антигенного и антительного диагностикумов с одинаковой чувствительностью. Известно, что чувствительность разных серий этих диагностикумов может различаться в 2-4 раза.
Учитывая это, одновременное исследование сывороток в РПГА и РНАг желательно проводить при условии использования антигенного и антительного диагностикумов с равной или близкой чувствительностью.
Рекомендуется предварительно проверить и сравнить чувствительность применяемой пары диагностикумов. В тех случаях, когда чувствительность антительного диагностикума более чем в 2 раза превышает чувствительность антигенного, необходимо делать соответствующие поправки при вычислении превышения титра РНАг над титром РПГА.
Одним из способов сравнительного определения чувствительности серий диагностикумов является одновременная постановка РПГА и РНАг с гипериммунной "стандартной" агглютинирующей сывороткой, практически лишенной неполных антител.
Трудоемкость постановки реакций имеет немаловажное значение, так как при проведении массовых исследований размеры затрачиваемого труда весьма существенны. Надо иметь в виду, что постановка трехкомпонентной реакции нейтрализации антигена (РНАг) занимает несколько больше времени и требует большей тщательности, нежели РПГА. Максимальное упрощение техники постановки реакций и учета результатов, повышение производительности труда за счет механизации отдельных процессов имеют весьма важное значение, особенно для лабораторий сезонных эпидотрядов, выполняющих большие по объему работы в ограниченные сроки.
Рассматриваемые ниже варианты применения серологических реакций разработаны для Среднеазиатского равнинного очага чумы, где, как известно, основным носителем чумы является большая песчанка. Вместе с тем принципиальные моменты предлагаемых рекомендаций в равной мере могут быть отнесены и к другим природным очагам чумы, с другими носителями. Необходимо лишь в каждом случае учитывать способность обитающих здесь видов животных к продуцированию чумных антител и прежде всего особенности динамики у них полных и неполных антител.
Итак, выбор схемы серологического исследования определяется задачей, поставленной перед эпизоотологическим обследованием.
В случаях, когда задача эпизоотологического обследования ограничена только поисками эпизоотических участков, с равным успехом можно применять и РПГА, и РНАг. Практика показывает, что возможности обеих реакций при этом оказываются одинаковыми, т.е. с помощью РПГА удается выявлять места циркуляции микроба чумы в природе практически с той же вероятностью, что и путем постановки РНАг. В большинстве случаев незначительной бывает и разница в количестве грызунов с антителами, выявляемых этими реакциями. Последнее объясняется тем, что в природе на участке эпизоотии заражение грызунов происходит не одномоментно и в пробу, таким образом, попадают грызуны с различной давностью контакта с возбудителем чумы. При этом с каждым днем увеличивается число выздоровевших грызунов и одновременно растет срок давности их контакта с возбудителем чумы, в связи с чем повышается эффективность РПГА, так как у этих животных продуцируются уже полные антитела. Близкие показатели РПГА и РНАг (процент грызунов с антителами, выявляемых этими реакциями) наблюдаются при медленно развивающейся эпизоотии. В отличие от этого при бурном, взрывном развитии эпизоотии за короткий промежуток времени на участке происходит контакт с микробом чумы большого числа грызунов. В данном случае в самом начале процесса разница в количестве грызунов, выявляемых РПГА и РНАг, бывает значительной. В такие весьма короткие периоды РНАг бывает эффективнее и потому предпочтительнее.
Однако использование только одной реакции (или РПГА, или РНАг) дает все же ограниченную информацию об эпизоотическом процессе, в частности, не позволяет с достаточной уверенностью определить фазу течения эпизоотии на конкретном участке и тенденцию дальнейшего ее развития. Следует иметь в виду, что такой показатель, как титр антител, мало пригоден для характеристики заболевания конкретного животного и не может быть использован для эпизоотологического анализа в полной мере, так как величина его, согласно экспериментальным данным, сильно варьирует даже при одинаковых условиях заражения, т.е. зависит от индивидуальной реактивности животного.
Значительно более полную информацию об эпизоотическом состоянии территории (участка) можно получить при исследовании грызунов одновременно в двух взаимно контролирующихся реакциях - РПГА и РНАг, т.е. в "системе однонаправленных реакций". При такой схеме исследования оказывается возможным использование для сравнительного анализа двух показателей: процента животных с антителами и, что особенно важно, высоты титра антител. Важным условием одновременного исследования материала в этих двух реакциях, как уже говорилось выше, является подбор диагностикумов с одинаковой или близкой чувствительностью.
Необходимо иметь в виду, что изредка в сыворотках грызунов и, напротив, весьма часто в сыворотках верблюдов и людей обнаруживаются гетерогенные антитела к бараньим эритроцитам (обычно в невысоких титрах-пределах 1:40 - 1:160). Они вызывают неспецифическую агглютинацию эритроцитов и затрудняют правильную оценку результатов. Методическими приемами подтверждения специфичности положительного результата являются: постановка реакции с контрольными эритроцитами или реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА), применение "системы реакций" (РПГА и РНАг) и, наконец, повторная постановка реакции после адсорбции гетерогенных антител 50% взвесью формалинизированных эритроцитов. Последний методический прием как более наглядный и эффективный получает все более широкое применение в практике.
При проведении массовых серологических исследований существенное значение приобретают такие моменты, как трудоемкость методики, сложность постановки реакций. В известных условиях это обстоятельство тоже может повлиять на выбор приема исследования. Наиболее проста схема, в которой используется только РПГА. При этом возможны два варианта исследования: первый - с параллельной постановкой контроля специфичности реакции с помощью контрольных эритроцитов, второй - без постановки контроля с каждой исследуемой сывороткой. Однако в последнем случае обязательна проверка специфичности всех положительных реакций, т.е. всех случаев гемагглютинации, полученных при первичном исследовании. Проверку проводят либо путем адсорбции сыворотки 50% взвесью формалинизированных эритроцитов и последующей повторной постановки РПГА (обычно в развернутом ряду), либо путем постановки реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА).
Необходимо также учитывать, что при исследовании материала только в РПГА не будут выявлены грызуны, в сыворотке которых отсутствуют полные антитела и содержатся только неполные, т.е. не будут обнаружены случаи свежего (недавнего) контакта грызунов с чумным микробом, представляющие наибольший эпизоотологический интерес.
Несмотря на простоту данной схемы исследования, последнее обстоятельство обусловливает относительно ограниченное применение при эпизоотологическом обследовании только одной РПГА.
В практике весьма часто применяют вариант, при котором первичное исследование материала проводят путем постановки только РНАг без предварительной обработки сывороток 50% взвесью формалинизированных эритроцитов. Предварительная обработка всех подлежащих исследованию сывороток, конечно, возможна, однако эта операция довольно трудоемкая, задерживающая получение результата анализа и, в конечном счете, вряд ли оправданная, так как в исследуемой пробе вообще может не оказаться сывороток, требующих адсорбции. Применение одной РНАг обычно сопровождается постановкой контроля с каждой исследуемой сывороткой (результат исследования достоверен, если в контрольной лунке не происходит агглютинации эритроцитов). Такой контроль позволяет не пропустить случаи одновременного присутствия в исследуемой сыворотке специфических чумных и гетерогенных антител.
Тем не менее в принципе возможен вариант исследования, в котором применяют РНАг без постановки контроля, хотя при этом и не исключена потеря части положительных результатов. В данном случае, как указывалось выше, останутся не- выявленными специфические антитела в тех сыворотках, в которых титр их невысок и одновременно содержатся гетерогенные антитела, вызывающие неспецифическую агглютинацию эритроцитов и искажающие фактический результат исследования. Как правило, такие случаи в обследовательской практике довольно редки. Но в некоторых случаях, в частности, при исследовании больших и краснохвостых песчанок в период развивающейся депрессии их численности, неспецифические антитела в сыворотках встречаются часто и титр их в отдельных случаях бывает довольно высоким (до 1:320 - 1:640). Аналогичное явление возможно и у других видов грызунов. В связи с этим не рекомендуется применять одну РНАг без параллельного контроля с каждой сывороткой в период депрессии численности грызунов, а также при исследовании животных, плохо образующих антитела к фракции I чумного микроба и дающих обычно невысокий титр в реакциях. Следует также напомнить, что большинство сывороток верблюдов и 30-40% сывороток людей содержат гетерогенные антитела к бараньим эритроцитам. Перед исследованием все сыворотки верблюдов и людей необходимо обрабатывать 50% взвесью формалинизированных эритроцитов.
Во всех остальных случаях, когда исключаются перечисленные выше ограничения, часто применяют вариант исследования, при котором все сыворотки сначала исследуют в РНАг, а затем все положительные также и в РПГА. Перестановку реакций при этом делают обязательно в развернутом ряду.
И все же наиболее рациональной и эффективной схемой серологического исследования животных на наличие антител к фракции I чумного микроба следует признать одновременную (параллельную) постановку РПГА и РНАг, т.е. системы однонаправленных реакций. При этом отпадает необходимость в постановке контроля специфичности результатов реакций. Некоторое повышение трудоемкости исследования в этом случае компенсируется простотой учета результатов - легкостью окончательной оценки достоверности реакции в сомнительных случаях, а также простотой выявления неспецифической агглютинации эритроцитов или одновременного присутствия в сыворотке специфических чумных и неспецифических антител. Главное же достоинство такой схемы - получение более полных данных для эпизоотологического анализа.
При массовых анализах первичную постановку реакций, независимо от избранной схемы исследования, целесообразнее делать в трех лунках (каждую реакцию). При постановке реакций в трех лунках для значительного числа положительных сывороток уже определяется титр антител (в РПГА, примерно, для 60% сывороток, в РНАг - для 45%) и легче выявляются случаи одновременного наличия в сыворотке специфических и неспецифических антител.
При необходимости ускоренного получения ответа, а также в случаях, когда материала мало и его может не хватить для повторного исследования, первичную постановку реакций проводят в развернутом ряду (8-12 лунок).
Анализ и эпизоотологическая оценка результатов серологического исследования животных на наличие антител
При использовании одной реакции (РПГА или РНАг) в итоге исследования определяется число (процент) животных с антителами к чумному микробу в данной пробе и титр антител. Судить о фазе эпизоотии на участке при условии однократного обследования по этим данным довольно трудно. Известно, правда, что высокий титр антител (например, у больших песчанок 1:1280 и выше) чаще свидетельствует об относительно недавнем контакте грызуна с возбудителем чумы. Однако этот признак нельзя считать абсолютно достоверным, поскольку высокий титр антител может оказаться результатом вторичного действия других ("неспецифических") инфекций, например, сальмонеллезов, пастереллезов и др. У грызунов, переболевших чумой, такие "вторичные" инфекции могут провоцировать повторную интенсивную выработку специфических антител к чумному микробу и, таким образом, способствовать удлинению периода их продуцирования и обнаружения.
Такой показатель, как процент грызунов с антителами в пробе, также не всегда может быть правильно оценен. Например, невысокий процент может быть и в начале, и в конце эпизоотии. Тенденцию развития процесса в этих случаях можно установить только путем неоднократного повторения обследования и сравнения получаемых показателей.
Принципы анализа и оценки, т.е. интерпретации результатов при одновременной постановке РПГА и РНАг разработаны на больших песчанках в Среднеазиатском равнинном очаге и успешно применены для малых сусликов в природном очаге чумы в Северо-Западном Прикаспии. Имеются также положительные данные и в отношении других видов носителей. Это свидетельствует о существовании общих закономерностей и позволяет рекомендовать излагаемые ниже принципы анализа и приемы интерпретации для всех природных очагов чумы.
При одновременном исследовании сывороток грызунов в двух реакциях титр РНАг, как правило, бывает выше, чем титр РПГА. Объясняется это, прежде всего, способностью РНАг выявлять помимо полных еще и неполные антитела, а также часто более высокой чувствительностью антительного диагностикума. Поскольку продуцирование неполных и полных антител у грызунов после их контакта с возбудителем начинается неодновременно и нарастание их титра происходит с неодинаковой интенсивностью, рекомендуется при обработке данных вычислять соотношение титров двух реакций для каждого грызуна. По соотношению титров у всей совокупности грызунов с антителами в конкретной пробе (при условии использования серий диагностикумов с равной или близкой чувствительностью) можно судить о фазе эпизоотии и определять тенденцию ее развития. Наибольшая разница в титрах наблюдается у животных, контактировавших с микробом в недавние сроки, так как неполные антитела, обуславливающие более высокий титр РНАг, появляются раньше полных и их концентрация в начальном периоде болезни нарастает значительно быстрее.
Для сравнения титров вычисляют относительный показатель - превышение титра, показывающий, во сколько раз титр РНАг выше титра РПГА. Полученные при анализе каждой пробы показатели располагают в вариационном ряду (см. таблицу).
Число случаев с превышением титра РНАг над титром РПГА (во сколько раз) |
Число случаев положительных только в РНАг с титром |
|||||
Титры равны |
2 |
4 |
8 |
16 и более |
1:20 - 1:40 |
1:80 и выше |
При обследовании эпизоотических районов могут быть получены самые разные показатели - от случаев, когда титры в обеих реакциях равны, до случаев, положительных в РНАг и в то же время отрицательных в РПГА. У больших песчанок, а также, по-видимому, и других грызунов число сывороток (в процентном выражении) с равными титрами зависит от давности возникновения эпизоотии на участке и интенсивности ее течения в прошлом. На участках, где эпизоотия прекратилась или интенсивность ее резко упала 4-3 месяца назад, но в свое время развитие ее происходило бурно, это число может достигать 50%, поскольку бурное развитие эпизоотии предполагает одновременный контакт с микробом чумы большого числа животных. Вполне понятно, что в местах стойкого течения эпизоотий сыворотки с равными титрами в РПГА и РНАг регистрируются также весьма часто. Напротив, на участках недавно возникшей эпизоотии таких случаев либо вовсе нет, либо они единичны. Равные титры РПГА и РНАг при условии использования одинаковых (или близких) по чувствительности серий диагностикумов говорят о том, что в сыворотке крови грызуна имеются только полные антитела. Титр в таких случаях сильно варьирует - у больших песчанок, например, от 1:20 до 1:10240. Факты обнаружения высоких значений титра антител в РПГА и РНАг при условии их равенства представляют особый эпизоотологический интерес. Вероятнее всего, в большинстве таких случаев мы имеем дело с грызунами, уже однажды контактировавшими с возбудителем чумы, поскольку повторный контакт, как известно, вызывает бурную выработку полных антител. Аналогичная динамика выработки антител регистрируется у заразившихся чумой молодых животных, родившихся от самки, ранее контактировавшей с микробом чумы. У таких молодых зверьков установлена определенная подготовленность к иммунологическому ответу, т.е. способность к более быстрой интенсивной продукции антител при встрече с возбудителем. Случаи с равными или близкими титрами РПГА и РНАг при большой величине их часто регистрируются у больших песчанок на участках стойкой очаговости чумы. В большинстве же случаев равенства титров величина их бывает 1:20 - 1:40, и такие факты следует расценивать как результат давнего контакта грызунов с возбудителем чумы.
Специального анализа и оценки требуют случаи с положительным результатом в РНАг и отрицательным в РПГА. У больших песчанок при этом титр антител в РНАг может колебаться в больших пределах - от 1:20 до 1:2560. Для данного вида грызунов значение титра 1:80 и выше надо расценивать как свидетельство недавнего первичного контакта с микробом чумы. Труднее расшифровка случаев с низким титром- 1:20-1:40. Здесь пока возможны лишь предположительные оценки. Так можно предположить, что это сыворотки грызунов, давно контактировавших с микробом чумы, у которых титр и полных, и неполных антител снизился настолько, что РПГА уже не обнаруживает антител, а РНАг оказывается положительной, поскольку она выявляет сумму полных и неполных антител, а также в ряде случаев по причине более высокой чувствительности антительного диагностикума. Логично также предположить, что это сыворотки животных, недавно контактировавших с возбудителем, у которых антитела только начали вырабатываться, а это, как известно, неполные антитела, обнаруживаемые в РНАг, но не выявляемые в РПГА. Последнее предположение представляется менее вероятным, так как у больших песчанок обычно наблюдается стремительное нарастание концентрации неполных антител в начальный период после контакта с возбудителем чумы. Следовательно, низкий титр антител в случаях, положительных только в РНАг, скорее свидетельствует о давнем эпизоотическом контакте.
Основную массу результатов, положительных в РПГА и РНАг, оценивают по показателю превышения титра. Для больших песчанок установлено, что при давнем контакте с возбудителем величина соотношения титров РНАг и РПГА при равной чувствительности диагностикумов не выходит за пределы двукратного превышения и, следовательно, укладывается в левой половине вариационного ряда. Напротив, свежие случаи эпизоотического контакта характеризуются превышением титра РНАг в 4-8-16 и более раз, что соответствует уже правой половине вариационного ряда. Таким образом, для разделения старых и свежих случаев контакта условную разграничительную черту в вариационном ряду следует провести между градациями 2 и 4 (критерии для большой песчанки и малого суслика). Эти расчеты применимы в случаях, когда чувствительность антигенного диагностикума не более чем в 2 раза превышает чувствительность антигенного диагностикума. При более значительном расхождении в чувствительности потребуются соответствующие поправки к расчетам.
Итак, схема эпизоотологической интерпретации результатов серологического исследования грызунов на наличие антител представляется в следующем виде.
Если при анализе пробы полевого материала с участка показатели превышения титра РНАг над титром РПГА укладываются в левой половине вариационного ряда, т.е. не выходят за пределы двукратного преобладания, и в то же время титры сывороток, положительных только в РНАг, не превышают 1:40, можно делать вывод, что эпизоотия на данном участке либо прекратилась, либо интенсивность ее резко упала, и произошло это относительно давно (таблица в приложении, участок 1).
Если наряду с указанными показателями выявляются также случаи значительного превышения титра РНАг (в 4-8-16 и более раз), а также случаи, когда титр антител в сыворотках, положительных только в РНАг, более высокий (1:80 и выше), есть основания считать, что эпизоотия на участке началась давно и продолжается в момент взятия пробы или протекала совсем недавно. Учитывая при этом распределение случаев с соответствующим превышением титра в вариационном ряду, можно оценить интенсивность течения эпизоотии (таблица в приложении, участки 2, 3).
При обследовании участков, где эпизоотия возникла (или обострилась) недавно и скорее всего протекает в момент взятия пробы, полученные показатели располагаются в правой половине вариационного ряда. Величина титра реакции, положительных только в РНАг, бывает очень большая - нередко достигает 1:2560 (таблица в приложении, участок 4).
Дополнительные материалы для оценки эпизоотической обстановки можно получить, если рассчитать и сравнить средние значения титров обеих реакций. Так, на участке давно прошедшей эпизоотии средние геометрические титры РПГА и РНАг становятся близкими и величина их небольшая. На участке недавно возникшей и развивающейся эпизоотии средние значения титра РПГА низкие, а РНАг - высокие (таблица в приложении) .
Приведенные критерии эпизоотологической интерпретации серологических данных разработаны для популяции больших песчанок, обитающих на полуострове Мангышлак. Нельзя исключить предположения, что при серологическом исследовании больших песчанок из других географических популяций будут установлены несколько иные количественные характеристики. При использовании приведенной схемы анализа в других природных очагах чумы необходимо определить свои критерии интерпретации данных, учитывая при этом способность основного носителя к антителообразованию и присущие данному очагу эпизоотологические закономерности.
Надо также иметь в виду, что для оценки эпизоотической обстановки с помощью предложенных критериев проба с каждого участка должна быть достаточно представительной. Это требование прежде всего относится к участкам, где эпизоотия давно прекратилась или, напротив, лишь недавно возникла. В подобных ситуациях для уверенной оценки потребуется получить до 30 положительных реакций с участка. Во всех случаях существенное значение для оценки имеет дополнительная эпизоотологическая информация.
<< Назад |
Раздел II. >> Техника серологического исследования |
|
Содержание Инструкция по применению серологических методов диагностики при эпизоотологическом обследовании природных очагов чумы (утв.... |
Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.