Откройте актуальную версию документа прямо сейчас
Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.
Раздел II
Техника серологического исследования
Подготовка материала к исследованию
Весь материал, поступающий в лабораторию на серологическое исследование, представляет потенциальную угрозу заражения чумой. Поэтому на первых этапах его подготовки к исследованию (до полного обеззараживания) все манипуляции проводят, соблюдая соответствующие требования режима работы с возбудителями особо опасных инфекций (подробнее об этом см. ниже).
При подготовке материала к серологическому исследованию условия стерильности не требуются.
Подготовка материала к исследованию на наличие антител к чумному микробу
Для исследования с целью обнаружения антител материал берут либо у живых животных, либо у животных, доставленных в лабораторию мертвыми.
Исследование сыворотки крови, взятой у живых грызунов, имеет определенные преимущества, поскольку позволяет более точно определить титр антител. Последнее особенно важно при проведении специальных экспериментальных работ. Однако это требует вылова, сохранения и доставки животных в лабораторию живыми, что представляет немалые организационные трудности и влечет за собой некоторые издержки (потеря эктопаразитов, сложность маркировки животных).
Исследование трупов животных удобнее при массовых обследованиях. Более того, этот методический прием является, по существу, единственно приемлемым для массового исследования мелких грызунов (полуденные песчанки, мышевидные), которых не удается вылавливать живыми в большом количестве. Хотя точность определения титра при этом более относительна, его отклонения от действительной величины, как правило, не превышают ошибки, которую допускает сама техника реакций с использованием двукратного титрования материала.
Многолетняя практика подтверждает практическую равноценность указанных двух способов подготовки материала. Иными словами, точность определения титра антител при исследовании материала от мертвых животных оказывается вполне достаточной для эпизоотологического анализа и необходимых оценок. Учитывая это, в местах, где применяется исследование живых грызунов, целесообразно проводить также исследование животных, доставляемых мертвыми, для получения более объемных материалов.
Поступивших в лабораторию живых грызунов предварительно подвергают рауш-наркозу в закрытых влажным полотенцем "биопробных" банках, либо умерщвляют наложением корнцанга на область шеи. Тотчас после умерщвления животного вскрывают грудную клетку и берут из правого желудочка сердца еще не свернувшуюся кровь в количестве, необходимом для проведения исследования (обычно от 0,5 до 3,0 мл, в зависимости от вида грызуна). При этом обязательно использование индивидуальных шприцев или пипеток либо тщательное 4-5-кратное промывание их свежими порциями физиологического раствора после каждого взятия крови. У относительно крупных животных (сурки, суслики, большие песчанки и др.) кровь можно брать из сердца, не вскрывая грудную клетку. При экспериментальных исследованиях, включающих прижизненные наблюдения за динамикой титра антител, кровь можно брать из сердца, из хвостовой, ушной или бедренной вены, из ретроорбитального синуса, при отсечении фаланги пальца.
Для получения сыворотки кровь сливают в пробирку, которую затем устанавливают наклонно. Отстоявшуюся сыворотку отсасывают пастеровской пипеткой в другую пробирку и разводят физиологическим раствором в 10 раз. С целью обеззараживания и консервации сывороток к ним добавляют мертиолят натрия до 1:10000 (на 1 мл разведенной сыворотки добавляют 2 капли по 0,05 мл предварительно приготовленного раствора мертиолята 1:1000). После добавления мертиолята сыворотки прогревают при 56° в течение 30 минут. Обработанный таким способом материал пригоден также для исследования на наличие капсульного чумного антигена.
При исследовании мертвых грызунов готовят суспензию сгустков крови из сердца и околосердечного пучка сосудов (такую суспензию принято называть "смывом"). Суспензию готовят непосредственно в грудной полости грызунов после взятия материала для бактериологического исследования. Для успешного приготовления смыва необходимо соблюдать определенные правила вскрытия грызунов. Так, разрезы в области грудной клетки должны проходить несколько ближе к грудине и затем сходиться у шеи. Диафрагму следует подрезать как можно ближе к грудине.
Суспензию (смыв) готовят следующим образом. Удаляют целиком легкие, стараясь не оставлять мелких кусочков. Ножницами (3-4 разрезами) рассекают сердца, аорту и другие крупные сосуды. Шприцем с толстой иглой вливают в грудную полость физиологический раствор с мертиолятом натрия 1:4000, направляя струю на измельченное сердце и сосуды так, чтобы суспензия заполнила грудную полость. После перемешивания иглой суспензии ее отсасывают тем же шприцем и в том же количестве, сколько было влито раствора, и переносят в пробирку. Для этой операции удобнее всего использовать шприц емкостью 2 мл и пробирки диаметром 14 мм. Смывы у всех грызунов берут одним и тем же шприцем, но после каждого взятия его промывают 4-5 раз свежими порциями физиологического раствора.
После взятия материала у всей партии грызунов смывам дают отстояться в течение 1-2 часов. За это время суспензия разделяется на комок сгустков, оседающий на дно пробирки, и просветленную, обычно слегка розовую надосадочную жидкость. В пробирки с отстоявшимися смывами добавляют физиологический раствор с мертиолятом натрия 1:8000 в строго определенном количестве, в зависимости от вида грызуна (см. ниже).
Манипуляцию разведения смывов удобнее всего выполнять с помощью мерной бюретки с одноходовым краном, винтовым зажимом и концевой иглой для шприцев. С помощью винтового зажима регулируют скорость истечения раствора таким образом, чтобы стекающая по стенке наклоненной пробирки жидкость перемешивалась с надосадочным слоем суспензии, но не взмучивала осадка. Не следует допускать при этом всплывания сгустка или кусочков тканей, так как это приводит к гемолизу и ухудшает качество смыва. Для приготовления и разведения смывов предпочтительнее применять забуференный физиологический раствор (на фосфатном буфере, рН-7,2). Подготовленные таким образом суспензии (вместе со сгустками) прогревают в течение 30 минут при 56°. Если эту операцию проводят на водяной бане, подогреваемой открытым пламенем, штатив с пробирками должен быть с ножками. Это позволит избежать излишнего нагрева дна пробирки, при котором происходит чрезмерное свертывание белка кровяных сгустков и снижается качество смывов.
Недопустимо изменение очередности манипуляций в ходе приготовления смыва. Нельзя взятую из грудной полости грызуна суспензию вливать в пробирку с заранее налитым физиологическим раствором, т.к. при этом резко снижается качество материала. После прогревания смывы выдерживают 12-14 часов. За это время полностью оседают взвешенные частицы и надосадочная жидкость просветляется. Если исследование смывов откладывается надолго, надосадочную жидкость во избежание гемолиза следует отсосать в другую пробирку. Качество смывов зависит также от степени свежести материала. Загнившие трупы животных не пригодны для исследования.
Для приготовления смывов от разных видов грызунов следует придерживаться определенных расчетов. Корректирующим фактором при этом должен быть размер (вес) животного.
При исследовании взрослых особей больших песчанок и малых сусликов в грудную полость вливают 1 мл и затем доливают в пробирку еще 3 мл физиологического раствора. Молодым особям (вес до 120 г) этих видов грызунов в грудную полость вливают 1 мл физиологического раствора и затем добавляют в пробирку 2 мл. Такие суспензии соответствуют примерно разведению 1:10 сыворотки крови. При исследовании полуденных песчанок в грудную полость взрослых животных вливают 0,5 мл и затем в пробирку добавляют еще 2,5 мл физиологического раствора. В таком виде суспензия соответствует примерно разведению 1:20 сыворотки крови. Для того, чтобы получить смыв примерно такой же концентрации у молодых полуденных песчанок, в грудную полость им вливают 0,5 мл и затем добавляют в пробирку еще 1,5 мл физиологического раствора. При исследовании краснохвостых и гребенщиковых песчанок суспензию готовят в 1 мл и добавляют затем 2 мл физиологического раствора, получая при этом суспензию, соответствующую примерно разведению 1:10 сыворотки крови.
У трупов крупных животных (сурки, желтые суслики, хищники) надо мерно взять кровь и затем после отстаивания долить в нее физиологический раствор из того расчета, что сыворотка составляет примерно половину объема взятой крови. Для других видов грызунов, являющихся массовыми объектами серологического исследования, точные расчеты для приготовления смывов могут быть получены путем проведения специальных экспериментов.
При подготовке к исследованию сывороток крови верблюдов их обязательно обрабатывают после прогревания 50%-ной взвесью формалинизированных эритроцитов, так как в большинстве случаев в этих сыворотках содержатся гетерогенные антитела к бараньим эритроцитам. Эритроциты добавляют из расчета 2 капли (по 0,05 мл) на 1 мл сыворотки, разведенной 1:10, и тщательно перемешивают встряхиванием. Затем сыворотку либо оставляют до полного оседания эритроцитов, либо центрифугируют после одночасовой выдержки при комнатной температуре. Точно так же надо обрабатывать сыворотки крови людей.
При исследовании свежих трупов верблюдов суспензию готовят из сгустков крови, взятой из сердца, после чего ее прогревают, отсасывают надосадочную жидкость в другую пробирку и уже затем обрабатывают 50%-ной взвесью эритроцитов.
Для разведения сывороток крови верблюдов и приготовления суспензий применяют физиологический раствор с мертиолятом натрия такой концентрации, чтобы в готовом к исследованию материале его содержание было не ниже, чем 1:10000.
Подготовка материала к исследованию на наличие капсульного антигена чумного микроба (фракции I)
Для исследования бактериальной взвеси культуры выращивают на агаре с кровью или с сульфитом натрия (лучше с добавлением хлористого кальция до 0,05-0,1%) при температуре 37° в течение 2-3 суток. Из выращенной культуры готовят взвесь с концентрацией 1 млрд микробов в 1 мл по стандарту мутности ГИСК. Взвесь готовят на физиологическом растворе с добавлением формалина до 4%, что обеспечивает ее полное обеззараживание в течение 1 часа. Затем часть взвеси разводят физиологическим раствором в 100 раз, т.е. до концентрации 10 млн микробов в 1 мл, и с этой взвесью ставят реакции. В случае отрицательного результата анализа в повторной реакции исследуют исходную взвесь с концентрацией 1 млрд микробов в 1 мл.
Для исследования свежих и загнивших трупов диких или лабораторных животных готовят суспензию из кусочков печени и селезенки путем растирания в ступке. При отсутствии этих органов у подобранного в поле трупа можно использовать кусочки легких и почек. Если на исследование попадают костные остатки трупа, суспензию готовят из растертых трубчатых костей и позвонков. Суспензию готовят сначала в небольшом (отмеренном) количестве физиологического раствора. Затем для разведения и обеззараживания к ней добавляют в соответствующем количестве раствор формалина. В готовой для серологического исследования суспензии концентрация формалина должна составлять 1-2%. В целях стандартизации разведения суспензий их готовят из расчета 9 частей разводящей жидкости на 1 часть материала. Например, 0,5 материала (количество определяется приблизительно) суспендируют в 1,5 мл физиологического раствора и затем в суспензию добавляют 3 мл формалина 2%-ной концентрации. Приготовленную таким образом суспензию выдерживают не менее 12 часов. Эффект обеззараживания может быть достигнут быстрее, если суспензию (с формалином) прогреть 30 минут при 56°. При этом, однако, не исключается некоторое снижение титра реакции. Обезвреживание материала достигается также кипячением в течение 3-5 минут, однако следует учитывать, что после такой обработки может снижаться титр реакции и чаще встречается неспецифическая гемагглютинация. Разведение формалина для приготовления суспензий делают из расчета, что концентрация коммерческого (продажного) формалина (или, что то же самое, 40%-ного раствора формальдегида) принимается за 100%. Используемую серию формалина предварительно проверяют. К работе пригодна серия формалина, обеспечивающая в применяемой концентрации (1-2%) стерилизацию заведомо зараженного материала. Контроль качества формалина удобнее всего проводить с суспензией органов погибшей от чумы белой мыши, посев которой на агаре дал сливной рост чумных колоний. Проверку проводят путем контрольных посевов разведенной (не менее чем в 100 раз) надосадочной жидкости суспензии на агаровые пластинки и последующего инкубирования их в течение 48 часов.
От грызунов с патологоанатомическими изменениями и павших биопробных животных на серологический анализ берут остатки суспензий органов, приготовленных для постановки биологической пробы.
При исследовании трупов верблюдов суспензию готовят из кусочков внутренних органов, костного мозга, костей, мышц, шкуры или соскобов с внутренней поверхности шкуры. При исследовании живых верблюдов берут кровь из вены, а при наличии у них бубонов, отечности в паховой области - пунктат из этих мест. Взятый материал обеззараживают формалином.
Подготовка к исследованию погадок хищных птиц проводится следующим образом. Погадки (каждую в отдельности или группу из 2-3-х) заливают 1% формалином так, чтобы избыток его составлял примерно 5-10 мл, и разминают. После отстаивания в течение 1-6 часов надосадочную жидкость отсасывают, прогревают 30 минут при 56° и при необходимости фильтруют через ватный тампон.
Для исследования субстрата гнезда грызунов желательно брать его целиком вместе с прилегающими слоями почвы. Менее желательным, но допустимым является исследование части субстрата гнезда; в таких случаях еще в поле или уже после доставки материала в лабораторию необходимо хорошо перемешать его и взять не менее 100 . Материал, после того как из него будут выбраны блохи, заливают 1%-ным формалином с избытком примерно в 10 мл, через 1-6 часов отсасывают надосадочную жидкость, прогревают ее 30 минут при 56° и при необходимости фильтруют. Достоверность результата серологического анализа порции гнездового субстрата почти такая же, как и при исследовании всего субстрата, однако титр антигена в первом случае может оказаться несколько ниже.
При исследовании погадок и субстрата гнезда рекомендуется применять реакцию нейтрализации антител (РНАт), выявляющую и полноценный чумной антиген, и гаптен.
При серологическом анализе блох применяют несколько способов подготовки их к исследованию.
В высокогорных очагах чумы с холодным климатом выбирают один из следующих вариантов: блох либо исследуют сразу же после сбора, либо сохраняют до исследования в условиях низкой температуры, либо, наконец, их помещают в консервант (1,5 мл на 50 блох), в котором они могут храниться до исследования длительное время даже при высокой (до 30°) температуре. В качестве консерванта рекомендуется либо 2%-ный раствор хлористого натрия с добавлением 1:200000 генцианвиолета (консервант Тифлова-Губиной), либо 1%-ный раствор формалина.
Применение указанных консервантов расширяет диагностические возможности, так как оба они могут быть исследованы в серологических реакциях, а консервант Тифлова-Губиной и извлеченные из него блохи, кроме того, могут быть подвергнуты бактериологическому исследованию.
Для одного серологического анализа следует брать не более 50 блох; к исследованию пригодны также высохшие и мацерированные насекомые.
Если блохи доставлены без консерванта, их тщательно растирают в ступке, часть суспензии при необходимости высевают на питательную среду, а к остатку приливают 1,5 мл физиологического раствора или 1%-ной нормальной кроличьей сыворотки. Затем суспензию переносят в пробирку, добавляют 1 каплю формалина и прогревают 30 минут при 56°. При необходимости жидкость фильтруют через ватный тампон с помощью шприца.
Если блохи извлечены из консерванта Тифлова-Губиной, то подготовка их к исследованию аналогична вышеописанной. Суспензию блох, извлеченных из формалина, не подвергают прогреванию. Для исследования в серологических реакциях самого консерванта Тифлова-Губиной его необходимо предварительно обеззаразить формалином.
При серологическом исследовании блох в пустынных очагах чумы с жарким климатом используют методический прием предварительного подращивания либо нерастертых блох, либо суспензии насекомых.
Подготовка к исследованию нерастертых блох проводится следующим образом. Собранных блох помещают в стерильную пробирку (до 30 экз.) и заливают 2-3 мл жидкой среды подращивания. Основу этой среды составляет бульон Хоттингера, в который добавлены генциан-виолет (1.300 000), сульфит натрия (0,03%) и поверхностно-активное вещество ОП-7 (3%). Поверхностно-активное вещество ОП-7 - это синтетическое масло, состоящее из смеси моно-диалкилфениловых эфиров полиэтиленгликоля. Оно способствует лучшей смачиваемости поверхностных тканей блохи, проникновению питательной среды в желудочно-кишечный тракт насекомого и размножению чумного микроба.
Пробирки с находящимися в среде подращивания блохами тщательно встряхивают и помещают в термостат при 37° на 48 часов. После инкубации из среды подращивания при необходимости делают высев на пластинку с агаром, а затем в пробирки для обеззараживания материала добавляют формалин в таком количестве, чтобы конечная концентрация его составляла 4%. Через 1-2 часа обеззараженную среду подращивания исследуют в серологических реакциях. С целью контроля специфичности реакций в лунку с наибольшей для данного опыта концентрацией исследуемого материала добавляют каплю антигенного диагностикума.
Подготовка к исследованию суспензии блох проводится аналогичным образом с той лишь разницей, что в среду подращивания не добавляют поверхностно-активного вещества.
Подготовка к исследованию посевов на твердых питательных средах осуществляется следующим образом. После просмотра чашек с посевами, инкубированными при 28°, те из них, на которых рост посторонней микрофлоры затрудняет обнаружение колоний чумного микроба, помещают на 24 часа в термостат при 37°. По окончании дополнительной инкубации на поверхность агара наливают 3-4 мл 4%-го раствора формалина, растирают шпателем микробную массу, стараясь не повредить агар, и затем пастеровской пипеткой отсасывают в пробирку полученный смыв всего микробного урожая. Смыв отстаивают (лучше на холоде) в течение 18-20 часов. В тех случаях, когда надосадочная жидкость недостаточно прозрачна, ее центрифугируют. Полученную надосадочную жидкость исследуют в реакциях.
Методика постановки серологических реакций
Материалы и лабораторное оборудование
1. Диагностикум чумной эритроцитарный антигенный. Препарат представляет собой формалинизированные эритроциты барана, обработанные танином и сенсибилизированные фракцией I чумного микроба, выпускается в жидком и сухом виде. Жидкий препарат - 10%-ная взвесь эритроцитов в растворе формалина 10%-ной концентрации. Сухой лиофилизированный препарат - высушенная в вакууме 10%-ная взвесь эритроцитов без добавления консерванта. Перед употреблением его разводят в соответствии с указаниями на этикетке. Для постановки реакций в полистироловых пластинках оба препарата применяются в 2,5%-ной концентрации.
2. Диагностикум чумной эритроцитарный антительный. Препарат представляет собой формалинизированные эритроциты барана, обработанные танином и сенсибилизованные гамма-глобулином сыворотки чумной агглютинирующей, выпускается в жидком и сухом виде. Жидкий препарат - 2,5%-ная взвесь эритроцитов в 0,5%-ном растворе формалина, т.е. в готовой для работы концентрации. Сухой лиофилизированный препарат - высушенная в вакууме 10%-ная взвесь эритроцитов. Перед употреблением его разводят в соответствии с указаниями на этикетке.
3. Контрольные эритроциты к антигенному диагностикуму.
Прилагаются к опытному диагностикуму и готовятся из той же серии эритроцитов барана. Эритроциты формалинизированы и обработаны танином, но в отличие от опытных ничем не сенсибилизированы. Выпускаются в 10%-ной концентрации. Для постановки реакций в полистироловых пластинках их разводят до 2,5%-ной концентрации.
4. Контрольные эритроциты к антительному диагностикуму. Прилагаются к опытному диагностикуму и готовятся из той же серии эритроцитов барана. Эритроциты формалинизированы, обработаны танином и сенсибилизированы гамма-глобулином сыворотки лошадиной нормальной. Жидкий препарат имеет 2,5%-ную концентрацию.
5. Взвесь (50%) формалинизированных эритроцитов барана. Применяется для извлечения из исследуемых сывороток гетерогенных антител к бараньим эритроцитам, вызывающих в ряде случаев неспецифическую гемагглютинацию. Взвесь эритроцитов добавляют из расчета - 2 капли (по 0,05 мл) на 1 мл готовой к исследованию, т.е. разведенной 1:10 и инактивированной сыворотки.
6. Раствор фракции I чумного микроба с концентрацией 10 микрограммов в 1 мл.
7. Взвесь клеток штамма ЕВ или К-1 с концентрацией 1 млрд м.к. в 1 мл, выращенных при 37° и убитых формалином.
8. Сыворотка чумная агглютинирующая в разведении 1:10 с титром в РПГА или РНАг не ниже 1 :200000.
9. Нормальная кроличья сыворотка, инактивированная в течение 30 минут при 56° и в необходимых случаях обработанная 50%-ной взвесью эритроцитов. Применяется в 0,5%-ной концентрации в качестве разводящей жидкости для постановки реакций. Для этих же целей можно применять нормальную лошадиную сыворотку в 0,5%-ной концентрации.
10. Мертиолят натрия (натрий этилртуть тиосалициловый)**. Применяется для обеззараживания и консервации исследуемых сывороток.
11. Физиологический раствор (рН-7,2) для разведения нормальной кроличьей сыворотки, диагностикумов и др. При исследовании мертвых грызунов для приготовления смывов лучше применять забуференный физиологический раствор (на фосфатном буфере рН-7,2).
12. Хлористый натрий. Используется для приготовления физиологического раствора из расчета - 8,6 г на 1 литр дистиллированной воды (весьма удобно для этих целей использование таблетированного хлористого натрия).
13. Полистироловые пластинки с лунками объемом 2 мл для постановки реакций.
14. Шприцы типа "Рекорд" емкостью 1 и 2 мл с ограничителями на 0,2 мл.
15. Тройники от шприца непрерывного действия, переоборудованные для тонкого шланга диаметром 1,5-2,0 мм.
16. Пипетки градуированные на 1 мл, 2 мл, 5 мл и 10 мл.
17. Бюретки градуированные на 50-100 мл с одноходовым краном и винтовым зажимом, смонтированные на штативах.
18. Пробирки диаметром 14 мм и бактериологические пробирки.
19. Иглы толстые к шприцам типа "Рекорд" ("игла от аппарата Боброва", иглы "И-52 диаметром 2,6 мм" или "И-51 N 2040 для взятия крови у донора").
20. Иглы длинные к шприцам типа "Рекорд" (N 12120 или N 12150).
21. Аппарат для свертывания и инактивирования сыворотки (МРТУ 422473-65) или Аппарат для инактивирования сыворотки (АИС 4Ц 697000).
22. Центрифуга лабораторная настольная (ЦЛН-2).
23. Микротитратор типа Такачи.
Подготовка и контроль ингредиентов для серологического исследования
В целях стандартизации приемов исследования рекомендуется при постановке реакций в полистироловых пластинках брать для анализа во всех случаях одинаковое количество исследуемого материала - 0,2 мл. Общий объем жидкости в каждой лунке как в трехкомпонентных (РНАг, РНАт, РТПГА), так и двухкомпонентной (РПГА) реакциях должен быть 0,4 мл. При этом во всех реакциях в первых лунках будет одинаковое разведение исследуемого материала. Доза диагностикума, добавляемая в каждую лунку, должна быть 0,03-0,05 мл. Каплю объемом 0,03 мл легко получить, подбирая толщину пастеровской пипетки (в 1 мл диагностикума должно быть 32-35 капель).
Весьма важно при постановке реакций, и особенно системы реакций, добиваться стандартного размера капли диагностикумов.
Приготовление рабочих взвесей диагностикумов. Для этого 10%-ную взвесь антигенного диагностикума и контрольных эритроцитов разводят физиологическим раствором или разводящей жидкостью до 2,5%-ной концентрации. Сухие диагностикумы (антигенный и антительный) разводят в соответствии с указаниями на этикетке.
Приготовление и контроль разводящей жидкости. Инактивированную нормальную кроличью или лошадиную сыворотку разводят 1:200 стерильным физиологическим раствором и добавляют формалин до 1%-ной концентрации.
Проверяют качество приготовленного раствора - контролируют отсутствие спонтанной агглютинации бараньих эритроцитов. Для этого в две луночки наливают по 0,2 мл разводящей жидкости и затем в одну лунку добавляют каплю (0,03-0,05 мл) антительного диагностикума, а в другую каплю контрольных антительных эритроцитов. Для такой проверки целесообразнее использовать именно антительные эритроциты, которые обычно более чувствительны к качеству разводящей жидкости. Содержимое лунок осторожно, но тщательно гомогенизируют встряхиванием. Результат учитывают через 3-4 часа. Контролируемые серии кроличьей сыворотки и физиологического раствора пригодны к работе, если эритроциты полностью осядут на дно лунок в виде маленькой пуговки или маленького колечка, т.е. без каких-либо признаков агглютинации. В противном случае надо сменить серию физиологического раствора, а если причиной агглютинации окажется кроличья сыворотка, ее необходимо обработать 50%-ной взвесью эритроцитов, предварительно разведя сыворотку 1:10.
Указанный контроль повторяют во всех случаях, когда начинают работать с новой серией кроличьей сыворотки или физиологического раствора.
Приготовление и контроль рабочего раствора сыворотки чумной агглютинирующей. Поступающий вместе с диагностикумом раствор сыворотки чумной агглютинирующей в разведении 1:10 дополнительно разводят физиологическим раствором в 2500 раз, получая разведение 1:25000. Процедуру разведения необходимо проводить способом титрования с соблюдением условий стерильности. Не следует готовить такой раствор сыворотки в больших количествах и применять после длительного хранения, так как при хранении снижается его активность (сыворотка хорошо сохраняет активность в разведении 1:1000).
После того, как приготовлен раствор сыворотки 1:25000, проверяют отсутствие спонтанной агглютинации бараньих эритроцитов в этом растворе. Для этого в лунку с 0,2 мл разводящей жидкости добавляют 0,2 мл приготовленного раствора сыворотки и после этого одну каплю (0,03-0,05 мл) контрольных эритроцитов (к антигенному диагностикуму). Сыворотка пригодна к работе, если в лунке не будет гемагглютинации и эритроциты осядут на дно в виде маленькой пуговки.
Контроль чувствительности антигенного диагностикума. В 6 лунок полистироловой пластинки наливают по 0,2 мл разводящей жидкости, затем в первую лунку добавляют 0,2 мл приготовленного раствора сыворотки чумной агглютинирующей 1:25000 и титруют переносом по 0,2 мл, получая таким образом ряд разведений сыворотки 1:50000, 1:100000, 1:200000, 1:400000 и т.д. Затем в каждую лунку добавляют еще по 0,2 мл разводящей жидкости и по одной капле (0,03-0,05 мл) антигенного диагностикума 2,5%-ной концентрации. Содержимое лунок тщательно перемешивают встряхиванием. Учет результата реакции проводят через 3-4 часа. Диагностикум считается годным, если он обнаруживает антитела при разведении сыворотки 1:100000 и более, т.е. если полноценная гемагглютинация произошла не менее, чем в двух лунках. Морфология реакции (зонтиков гемагглютинации) должна быть четкой, не затрудняющей учет. Допускается фестончатое оплывание краев агглютината.
Приготовление и контроль рабочего раствора антигена. Готовят раствор фракции I с концентрацией 0,1 мкг в 1 мл, для чего раствор, содержащий 10 мкг в 1 мл, разводят физиологическим раствором способом титрования в 100 раз. При отсутствии раствора фракции I готовят взвесь микробных клеток штамма ЕВ или К-1 с содержанием 10 млн. м.к. в 1 мл, для чего к 0,1 мл взвеси с концентрацией 1 млрд м.к. в 1 мл добавляют 9,9 мл физиологического раствора.
После того, как приготовлен рабочий раствор антигена, проверяют отсутствие спонтанной агглютинации бараньих эритроцитов в этом растворе. Для этого в лунку с 0,2 мл разводящей жидкости добавляют 0,2 мл приготовленного раствора антигена и после этого одну каплю (0,03-0,05 мл) контрольных антительных эритроцитов. Антиген пригоден к работе, если в лунке не произойдет гемагглютинации и эритроциты осядут на дно в виде маленькой пуговки.
Контроль чувствительности антительного диагностикума. В 6-8 лунок полистироловой пластинки наливают по 0,2 мл разводящей жидкости, затем в первую лунку добавляют 0,2 мл приготовленного раствора фракции 1 с концентрацией 0,1 мкг/мл, или 0,2 мл микробной взвеси, содержащей 10 млн м.к. в 1 мл, и титруют переносом по 0,2 мл, получая таким образом ряд с содержанием антигена в лунках - 0,01; 0,005; 0,0025 мкг и т.д., или 1 млн, 500 тыс., 250 тыс. м.к. и т.д. Затем в каждую лунку добавляют еще по 0,2 мл разводящей жидкости и по одной капле (0,03-0,05 мл) антительного диагностикума. Содержимое лунок тщательно перемешивают встряхиванием. Учет результата реакции проводят через 3-4 часа. Диагностикум считается годным, если он выявляет антиген при содержании его в лунке - 0,0025 мкг, или 62 тыс. м.к., и менее (соответственно 0,0125 мкг/мл, или 312 тыс. м.к. и менее в 1 мл). Эритроциты должны давать четкую полноценную агглютинацию (светлые зонтики, нередко с оплывающим краем, занимающие не менее 2/3 дна лунки). В лунках, где антигена очень мало (или он отсутствует), эритроциты должны оседать в виде маленькой пуговки или колечка темно-коричневого цвета с ровным краем.
Приготовление раствора антигена для постановки РНАг. Готовят раствор фракции 1 или взвесь микробных клеток ЕВ или К-1 строго определенной концентрации. В объеме, применяемом для постановки реакции, т.е. в 0,2 мл, должны содержаться 2 гемагглютинирующие единицы (2ГЕ) антигена. Методика приготовления раствора изложена ниже.
Приготовление раствора сыворотки чумной агглютинирующей для постановки РНАт. Готовят раствор сыворотки строго определенной концентрации. В объеме, применяемом для постановки реакции (0,2 мл), должны содержаться 2 гемагглютинирующие единицы (2ГЕ) сыворотки. Методика приготовления раствора изложена ниже.
Приготовление раствора антигена и сыворотки чумной агглютинирующей для постановки реакции торможения (РТПГА). Готовят растворы антигена и сыворотки такой концентрации, чтобы 0,2 мл этих растворов были способны нейтрализовать 20-40 гемагглютинирующих единиц определяемого вещества (в первом случае - сыворотки, во втором - антигена). Методика приготовления растворов изложена ниже.
Приготовление рабочих растворов мертиолята натрия. Мертиолят натрия применяют для обеззараживания и консервации материала, предназначенного к исследованию на наличие антител (использовать для этих целей формалин нельзя, т.к. он нейтрализует антитела). Готовят маточный раствор мертиолята 1:400. Затем из него готовят два раствора: 1:4000 для взятия смывов у грызунов и 1:8000 для разведения смывов и сыворотки. При использовании указанных растворов в готовом к исследованию материале обеспечивается разведение мертиолята около 1:10000.
Исследование материала на наличие антител к чумному микробу
Методика постановки реакции пассивной гемагглютинации (РПГА)
В ряд лунок полистироловой пластинки наливают по 0,2 мл разводящей жидкости. В первую и последнюю лунки добавляют по 0,2 мл готового к исследованию материала (смыв, сыворотка в разведении 1:10) и титруют переносом по 0,2 мл до предпоследней лунки. Из предпоследней и последней лишние 0,2 мл выливают***. В результате в лунках получают следующий ряд разведений материала: 1:20, 1:40, 1:80 и т.д. В каждую лунку дополнительно наливают 0,2 мл разводящей жидкости, доводя, таким образом, объем раствора до 0,4 мл. Затем во все лунки, кроме последней, добавляют по одной капле (0,03-0,05 мл) антигенного диагностикума, а в последнюю - одну каплю контрольных эритроцитов. После внесения диагностикума пластинку осторожно встряхивают, добиваясь полного перемешивания эритроцитов в лунках (до гомогенизации) и оставляют при комнатной температуре на горизонтально установленном столе, оберегая от толчков, перемещений и т.д. Первый учет результатов производят через 3-4 часа, когда уже можно получить принципиальный ответ, т.е. отличить положительный результат от отрицательного. Окончательное определение титра антител следует проводить лишь после полного оседания эритроцитов в лунках.
Результат реакции считается достоверным, если в лунке с контрольными эритроцитами не будет гемагглютинации (рис. 1, проба 1). Агглютинация эритроцитов в контроле свидетельствует о присутствии в исследуемом материале неспецифических антител к бараньим эритроцитам (рис. 1, проба 3). В таких случаях сыворотку подвергают адсорбции 50%-ной взвесью формалинизированных эритроцитов, после чего повторно ставят реакцию.
Учет результатов проводится по следующей схеме: знаком "+" обозначают полноценную гемагглютинацию, когда эритроциты выпадают на дно лунки равномерным слоем в виде зонтика, занимающего не менее 2/3 дна, у которого нередко наблюдается фестончатое оплывание краев; знаком "_" обозначают частичную гемагглютинацию, при которой эритроциты выпадают на дно в виде рыхлого кольца небольшого размера;
знаком "-" обозначают отсутствие гемагглютинации, когда эритроциты выпадают на дно лунки в виде маленькой темно-коричневой пуговки или очень маленького колечка с ровным краем.
______________________________
* Точно такая же схема постановки и учета результатов РПГА с антительным диагностикумом при исследовании материала на наличие фракции I.
Специфическая агглютинация эритроцитов происходит в том случае, когда в исследуемом материале есть антитела к фракции 1 чумного микроба. Титром сыворотки считают максимальное ее разведение, при котором еще наблюдается полноценная гемагглютинация. Таким образом, разведение, оцененное знаком "_", в учет не принимается. В тех случаях, когда при первичном исследовании (т.е. в 3 лунках) титр установить не удалось, проводят повторную перестановку реакций уже в развернутом ряду (до 12 лунок). При очень высокой концентрации антител в исследуемом материале титрование следует производить со сменой или промывкой шприца во избежание заноса материала и искусственного завышения титра. Надо также иметь в виду, что при очень высокой концентрации антител в исследуемом материале в первых лунках РПГА может не произойти агглютинации эритроцитов (так называемый феномен зоны). Специфичность положительного результата, полученного в РПГА, может быть проверена трехкомпонентной реакцией - РТПГА.
Методика постановки реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА)
Эту реакцию ставят для подтверждения специфичности положительного результата РПГА во всех случаях, представляющих особый эпизоотологический или эпидемиологический интерес. Суть механизма реакции заключается в специфическом торможении агглютинации эритроцитов при добавлении к испытуемой сыворотке фракции I чумного микроба или взвеси убитых клеток чумного микроба. В реакции, таким образом, взаимодействуют три компонента: определяемые антитела (испытуемая сыворотка), специфический чумной антиген (фракция I) и антигенный диагностикум.
Реакцию торможения обычно ставят в развернутом ряду (6-12 лунок). Целесообразно параллельно с РТПГА ставить повторную РПГА.
В два ряда лунок разливают по 0,2 мл разводящей жидкости, затем в первые лунки обоих рядов вносят в объеме 0,2 мл испытуемую сыворотку или смыв и титруют. Получают, таким образом, два совершенно одинаковых ряда разведений сыворотки. Во все лунки второго ряда добавляют по 0,2 мл разводящей жидкости, а в лунки первого ряда - по 0,2 мл раствора фракции I или взвеси стандартной культуры такой концентрации, чтобы в этом объеме содержалось количество антигена, способное нейтрализовать 20-40 гемагглютинирующих единиц сыворотки.
При использовании фракции I готовят раствор с концентрацией 0,5 мкг/мл, а при использовании "стандартной" культуры чумного микроба - взвесь с концентрацией 10 млн м.к. в 1 мл.
После добавления антигена пластинку оставляют на 1 час при комнатной температуре или на 30 минут при 37°. Затем во все лунки обоих рядов добавляют по одной капле (0,03-0,05 мл) антигенного диагностикума, пластинку встряхивают и оставляют на ровном столе. Учет проводят через 3-4 часа. Если в испытуемой сыворотке содержатся специфические антитела к фракции I, они нейтрализуются добавленным антигеном, и поэтому в первом ряду лунок гемагглютинации не произойдет и эритроциты выпадут на дно в виде пуговок (рис. 2, проба 1). В случае, когда титр специфических антител в испытуемой сыворотке очень высокий (выше 1:640), в первых лунках этого ряда антитела останутся в избытке и вызовут агглютинацию эритроцитов, т.е. число лунок с гемагглютинацией уменьшится по сравнению с первоначальным результатом (рис. 2, проба 2). Если же в испытуемой сыворотке содержатся гетерогенные антитела, вызывающие неспецифическую реакцию, то гемагглютинация произойдет и в первом, и во втором ряду лунок. Сыворотки перед проверкой в РТПГА целесообразно адсорбировать 50%-ной взвесью эритроцитов.
______________________________
* Точно такая же схема постановки и учета результатов РТПГА с антительными эритроцитами при исследовании материала на наличие фракции I.
Методика постановки реакции нейтрализации антигена (РНАг)
Реакция нейтрализации антигена - высокоспецифичная трехкомпонентная реакция. Сущность механизма ее состоит в специфической нейтрализации вводимого в реакцию антигена (фракции I) антителами, содержащимися в исследуемом материале.
В ряд лунок полистироловой пластинки наливают по 0,2 мл разводящей жидкости. Затем в первую и последнюю лунку вносят по 0,2 мл исследуемого материала (смыв, сыворотка в разведении 1:10) и титруют переносом по 0,2 мл до предпоследней лунки. Из предпоследней и последней лунок лишние 0,2 мл выливают. Получают, таким образом, следующий ряд разведений материала - 1:20; 1:40; 1:80 и т.д. После этого во все лунки добавляют по 0,2 мл раствора фракции I или взвеси стандартной культуры такой концентрации, чтобы в этом объеме содержались 2 гемагглютинирующие единицы (2ГЕ) антигена (методику определения ГЕ и приготовления раствора антигена см. ниже). Поскольку после добавления во все лунки по 0,2 мл раствора антигена материал из лунок не забирается, количество его в лунках остается тем же, что было получено после титрования, а значит, прежними надо считать и его разведения 1:20; 1:40; 1:80 и т.д.
После добавления антигена пластинку оставляют на 1 час при комнатной температуре или на 30 минут при 37°. Затем во все лунки, кроме последней, добавляют по одной капле (0,03-0,05 мл) антительного диагностикума, а в последнюю лунку - одну каплю контрольных антительных эритроцитов. Пластинку встряхивают до полной гомогенизации содержимого лунок и оставляют на ровном столе. Учет проводят через 3-4 часа.
Если в исследуемой сыворотке есть антитела к фракции I чумного микроба, то в первых лунках ряда, где количество их большее, они полностью нейтрализуют внесенный антиген в дозе 2 ГЕ. Добавленные в лунки эритроциты не агглютинируются и скатываются на дно лунки в виде пуговок. Результат реакции в таких лунках в первичных протоколах отмечается знаком "-", но учитывается как положительный (рис. 3, проба 1). В последних лунках, где антител содержится меньше, внесенный антиген остается в избытке и вызывает агглютинацию антительных эритроцитов. Аналогичная картина наблюдается в тех случаях, когда в исследуемой сыворотке вовсе нет антител (рис. 3, проба 2). Результат такой реакции (в лунке) обозначается знаком "+", но учитывается как отрицательный. В промежуточных лунках, где произошла частичная нейтрализация внесенного антигена, наблюдается частичная гемагглютинация, которая обозначается знаком "_". При положительном результате исследования крайняя лунка (т.е. максимальное разведение сыворотки), в которой еще отсутствует агглютинация эритроцитов, оценивается как титр реакции. Положительный результат реакции засчитывают, если в контрольной лунке эритроциты выпали на дно в виде пуговки или маленького колечка. Если в контроле наблюдается агглютинация эритроцитов, значит в исследуемом материале содержатся неспецифические антитела к эритроцитам барана (рис. 3, пробы 3 и 4). Такую сыворотку (смыв) подвергают обработке 50%-ной взвесью формалинизированных бараньих эритроцитов, после чего повторно ставят РНАг.
______________________________
* Точно такая схема учета результатов РНАт (с антигенным диагностикумом) при исследовании материала на наличие фракции I.
Как говорилось выше, при использовании системы реакций "РПГА и РНАг" отпадает необходимость в постановке контроля специфичности с каждой исследуемой сывороткой, т.к. эти две реакции взаимно контролируют полученные результаты (рис. 4).
При постановке РНАг количество вводимой в реакцию фракции I должно соответствовать расчетному (2ГЕ в объеме 0,2 мл). Завышение дозы антигена приведет к избытку ее во всех лунках, вследствие чего будет занижен титр реакции, а при исследовании сывороток с невысоким титром антител может быть вообще получен отрицательный результат. Из сказанного следует, что при постановке РНАг наиболее ответственной операцией является определение ГЕ и контроль ее.
Определение гемагглютинирующей единицы (ГЕ) антигена проводят следующим образом.
В 8-10 лунок наливают по 0,2 мл разводящей жидкости. В первую лунку добавляют 0,2 мл раствора фракции I с концентрацией 0,1 мкг/мл и титруют переносом по 0,2 мл. Учитывая, что в первую лунку было внесено 0,02 мкг фракции I, после титрования получают ряд лунок со следующим содержанием антигена.
N лунок |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
Количество антигена (мкг) |
0,01 |
0,005 |
0,0025 |
0,0012 |
0,0006 |
0,0003 |
0,00015 |
В каждую лунку этого ряда добавляют по одной капле (0,03-0,05 мл) антительного диагностикума, встряхиванием перемешивают содержимое лунок и пластинку оставляют до полного оседания эритроцитов (3-5 часов), после чего проводят учет.
Допустим в качестве примера, что полноценная агглютинация эритроцитов произошла в 5 лунках. Количество антигена, содержащееся в последней лунке с полноценной гемагглютинации, и есть одна гемагглютинирующая единица антигена. Другими словами, 1 ГЕ - это минимальное количество антигена, вызывающее агглютинацию одной капли (0,03-0,05 мл) антительных эритроцитов. Итак, в нашем примере 1 ГЕ антигена содержится в 5-й лунке и равна 0,0006 мкг, а 2 ГЕ - в 4-й лунке и равны 0,0012 мкг. Следовательно, для постановки РНАг необходимо приготовить такой раствор антигена, чтобы в 0,2 мл его содержалось 0,0012 мкг (т.е. 2 ГЕ), а это значит, что в 1 мл должно быть 0,006 мкг фракции I. Для приготовления 100 мл рабочего раствора антигена для постановки РНАг потребуется 0,6 мкг фракции I, т.е. 6 мл исходного раствора с концентрацией 0,1 мкг/мл.
Расчет концентрации рабочего раствора антигена для РНАг можно произвести другим, более простым способом. В приведенном выше примере 2 ГЕ антигена содержатся в 4-й лунке. При титровании исходный раствор антигена был разведен: в первой лунке - в 2 раза, во второй - в 4 раза, в третьей - в 8 раз и в четвертой - в 16 раз. Следовательно, для приготовления рабочего раствора антигена для РНАг надо развести исходный раствор в 16 раз.
В тех случаях, когда для постановки РНАг вместо фракции I применяют взвесь стандартной культуры чумных бактерий, определение ГЕ и расчет концентрации рабочего раствора производят точно таким же путем.
Приготовленный на основании расчетов рабочий раствор антигена обязательно контролируют. Такой предварительный контроль необходим для того, чтобы удостовериться в правильности расчетов и, если потребуется, внести поправки.
Контроль ставят следующим образом. Первую лунку отведенного для контроля ряда оставляют пустой, а в последующие 4-5 лунок наливают по 0,2 мл разводящей жидкости. Затем в первую и вторую лунки наливают по 0,2 мл контролируемого раствора антигена и титруют, начиная со второй лунки (!). После этого во все лунки добавляют по 0,2 мл разводящей жидкости и по одной капле (0,03-0,05 мл) антительного диагностикума. Пластинку встряхивают и оставляют до полного оседания эритроцитов (3-5 часов). Если полноценная гемагглютинация произойдет только в первых двух лунках, значит концентрация рабочего раствора антигена рассчитана правильно, (т.е. в первой лунке 2 ГЕ, во второй - 1 ГЕ, в третьей - 0,5 ГЕ и т.д.). Если с первого раза не удалось получить требуемую концентрацию, ее подбирают опытным путем, уменьшая или увеличивая (по необходимости) количество физиологического раствора или антигена. При этом каждый раз повторяют контроль. Наиболее подходящей для постановки РНАг считается такая концентрация рабочего раствора антигена, при контроле которой во второй лунке, где содержится 1 ГЕ, зонтик, оставаясь четким, имеет уже несколько меньший, чем в первой лунке, диаметр, а в третьей лунке, где 0,5 ГЕ, наблюдается колечко среднего размера.
Контроль рабочего раствора антигена повторяют одновременно с каждой постановкой реакций. При этом контрольный ряд используют также в качестве шаблона для учета результатов (т.е. определения титра) РНАг. В титр засчитывают лунку, форма осадка (осевших эритроцитов) в которой такая же, как в третьей лунке контрольного ряда, где содержится 0,5 ГЕ. В титр, таким образом, засчитывают разведение сыворотки, которое нейтрализует более половины внесенного количества антигена (т.е. 1,5 ГЕ из 2 ГЕ). Величину гемагглютинирующей единицы антигена определяют заново для каждой серии антительного диагностикума и каждой серии фракции I или микробной взвеси.
В тех случаях, когда при текущем контроле рабочего раствора антигена обнаружится, что концентрация его отличалась от расчетной, потребуется внести соответствующие поправки в оценку результатов, поставленных реакций. Так, если был применен раствор антигена с содержанием 1 ГЕ в 0,2 мл, необходимо уменьшить результат (титр) реакции в 2 раза, если же раствор содержал 4 ГЕ в 0.2 мл (т.е. агглютинация в контроле была в 3-х лунках), титр реакции следует увеличить в 2 раза. При гемагглютинации в контрольном ряду более чем в 3-х лунках (более 4 ГЕ в 0,2 мл) результат реакций не может быть засчитан. В этом случае необходимо заново рассчитать, приготовить и проконтролировать рабочий раствор антигена и повторно поставить реакции.
Следует помнить, что при постановке любых серологических реакций, связанных с применением фракции I или микробной взвеси, необходимо проявлять большую осторожность и не допускать случайного попадания антигена в рабочие растворы в антительный диагностикум, контрольные эритроциты, разводящую жидкость и др. Ничтожные количества антигена, попавшие в лунки полистироловых пластинок, а также в шприцы, пипетки, могут исказить результаты исследования. В связи с этим все манипуляции с антигеном должны проводиться отдельными пипетками, шприцами и другими приспособлениями. Не рекомендуется при проведении массовых исследований ставить РПГА и РНАг на одной и той же пластинке.
Исследование материала на наличие капсульного антигена чумного микроба (фракции I)
Специфический антиген (фракцию I) чумного микроба можно обнаружить путем постановки двухкомпонентной реакции РПГА с использованием антительного диагностикума или трехкомпонентной реакции РНАт, в которой применяется антигенный диагностикум.
При выборе приема исследования надо исходить прежде всего из диагностической ценности той или иной реакции для поиска антигена в разных объектах.
Известно, что РПГА с антительным диагностикумом выявляет в исследуемом материале только полноценный капсульный антиген. При добавлении диагностикума к материалу, содержащему полноценный антиген, происходит агглютинация эритроцитов. Следует, однако, иметь в виду, что при очень высокой концентрации антигена в исследуемом материале в первых лунках может не произойти агглютинации эритроцитов (так называемый феномен зоны).
Полноценный капсульный антиген содержится во взвеси клеток чумного микроба, выращенных при 37°, в относительно свежем трупном материале, в блохах, недавно пивших кровь больного чумой животного. В отличие от этого в погадках хищных птиц, в костях млекопитающих, пролежавших долгое время, обычно содержится лишь неполноценный антиген (гаптен), обладающий иной серологической активностью по сравнению с полноценным антигеном. Гаптен вступает в специфическую связь с чумными антителами, но не способен вызывать агглютинацию антительных эритроцитов. В связи с такой особенностью гаптен может быть обнаружен в трехкомпонентной реакции нейтрализации антител (РНАт).
Учитывая все сказанное выше, РПГА с антительными эритроцитами следует применять при исследовании культур чумного микроба, свежего трупного материала и других объектов, в которых предполагается наличие полноценного антигена. Погадки хищных птиц, старые кости животных и другие материалы, где вероятно присутствие только гаптена, надо исследовать в РНАт.
При исследовании костей сравнительно недавно погибших животных, а также, вероятно, субстрата гнезд грызунов, где можно предполагать наличие как полноценного антигена, так и гаптена, целесообразно применять одновременно РПГА с антительным диагностикумом и РНАт, т.е. систему однонаправленных реакций. Эффективность и титр РНАт при исследовании таких объектов бывает выше, поскольку эта реакция выявляет суммарное количество антигенов в материале.
Техника постановки реакций, предназначенных для поиска фракции I, точно такая же, как у описанных выше реакций для поиска антител.
Методика постановки реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с антительным диагностикумом
В лунки полистироловой пластинки наливают по 0,2 мл разводящей жидкости. Затем в первую и последнюю лунки добавляют по 0,2 мл исследуемого (обеззараженного!) материала и титруют до предпоследней лунки. Из предпоследней и последней лунок лишние 0,2 мл выливают, а затем в каждую лунку добавляют по 0,2 мл разводящей жидкости. Во все лунки, кроме последней, добавляют по одной капле (0,03-0,05 мл) антительного диагностикума. а в последнюю лунку - одну каплю контрольных антительных эритроцитов. Пластинку встряхивают, добиваясь полной гомогенизации содержимого лунок, и оставляют на горизонтально установленном столе при комнатной температуре. Через 3-4 часа проводят учет.
При наличии в исследуемом материале фракции I в лунках произойдет агглютинация эритроцитов. Последняя лунка с полноценной гемагглютинацией (где эритроциты выпали на дно равномерным слоев в виде зонтика, занимающего не менее 2/3 дна лунки) берется в учет при определении титра. Поскольку при исследовании суспензий органов животных, костей, погадок, субстрата гнезда, блох и некоторых других объектов нельзя точно установить исходное разведение материала, титр реакции при исследовании перечисленных объектов удобнее выражать числом лунок с полноценной гемагглютинацией. При исследовании специально приготовленных микробных взвесей титр следует выражать числом микробных клеток.
Результат считается достоверным, если в лунке с контрольными эритроцитами не будет гемагглютинации. Агглютинация эритроцитов в контроле свидетельствует о присутствии в исследуемом материале компонентов, вызывающих неспецифическое склеивание бараньих эритроцитов. В таких случаях материал подвергают обработке 50% взвесью формалинизированных эритроцитов барана, после чего повторно ставят реакцию.
Специфичность положительного результата РПГА с антительным диагностикумом может быть проверена в трехкомпонентной реакции - РТПГА.
Методика постановки реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА) с антительным диагностикумом
Реакция отличается высокой специфичностью и применяется во всех ответственных исследованиях. Механизм этой реакции состоит в специфическом торможении агглютинации эритроцитов при добавлении к исследуемому материалу сыворотки чумной агглютинирующей. В реакции, таким образом, взаимодействуют три компонента: фракция I чумного микроба, сыворотка чумная агглютинирующая и антительный диагностикум.
Реакцию торможения обычно ставят в развернутом ряду (6-12 лунок). Целесообразно параллельно с РТПГА повторно ставить РПГА.
Постановку РТПГА проводят следующим образом: исследуемый материал титруют, как и во всех других реакциях, в объеме 0,2 мл. Затем во все лунки добавляют по 0,2 мл сыворотки чумной агглютинирующей в концентрации, обеспечивающей связывание не менее 20-40 гемагглютинирующих единиц антигена. Поскольку стандартная сыворотка, прилагаемая к диагностикуму, дает положительную РПГА обычно в разведении 1:200000 - 1:400000, для обеспечения содержания 20-40 нейтрализующих единиц в 0,2 мл сыворотки ее применяют в разведении 1:10000 (прилагаемую стандартную сыворотку разводят в 1000 раз физиологическим раствором). Итак, при постановке РТПГА во все лунки, где протитрован исследуемый материал, добавляют по 0,2 мл агглютинирующей сыворотки в разведении 1:10000. Пластинку выдерживают 1 час при комнатной температуре или 30 мин при 37°, после чего во все лунки добавляют по одной капле (0,03-0,05 мл) антительного диагностикума. Учет проводят через 3-4 часа. Специфичность положительного результата подтверждается, если в лунках совсем не будет агглютинации эритроцитов или число лунок с гемагглютинацией будет на 4-6 меньше, чем в РПГА.
Методика постановки реакции нейтрализации антител (РНАт)
Реакция нейтрализации антител - высокоспецифичная трехкомпонентная реакция. Сущность механизма ее состоит в специфической нейтрализации чумной агглютинирующей сыворотки, специально добавляемой в реакцию, полноценным антигеном, и гаптеном, содержащимися в исследуемом материале.
В ряд лунок полистироловой пластинки наливают по 0,2 мл разводящей жидкости. Затем в первую и последнюю лунки добавляют по 0,2 мл исследуемого материала (взвесь микробов, суспензия органов и т.д.) и титруют переносом по 0,2 мл до предпоследней лунки. Из предпоследней и последней лунок лишние 0,2 мл выливают. Во все лунки добавляют по 0,2 мл раствора сыворотки чумной агглютинирующей такой концентрации, чтобы в этом объеме содержались 2 гемагглютинирующие единицы (2 ГЕ) сыворотки (методику определения ГЕ см. ниже). Пластинку оставляют на 1 час при комнатной температуре или на 30 минут при 37°. Затем во все лунки, кроме последней, добавляют по одной капле (0,03-0,05 мл) антигенного диагностикума, а в последнюю лунку - одну каплю контрольных эритроцитов. Содержимое лунок гомогенезируют встряхиванием, и пластинку оставляют на ровном столе. Учет проводят через 3-4 часа.
Если в исследуемом материале есть полноценный антиген или гаптен, то в первых лунках, где количество их больше, они полностью нейтрализуют антитела сыворотки, внесенной в количестве 2 ГЕ. Добавленные эритроциты в этих лунках не агглютинируются и скатываются на дно в виде пуговок. Результат реакции в таких лунках отмечается в первичных протоколах знаком "-", но учитывается как положительный. В последующих лунках, где антигена содержится меньше, внесенные антитела остаются в избытке и вызывают агглютинацию антигенных эритроцитов.
Аналогичная картина наблюдается в тех случаях, когда в исследуемом материале вовсе нет антигена. Результат такой реакции (в лунке) обозначается знаком "+" и учитывается как отрицательный. В промежуточных лунках, где произошла частичная нейтрализация внесенных антител, наблюдается частичная гемагглютинация, которая обозначается знаком "". При положительном результате исследования крайняя лунка, в которой еще отсутствует агглютинация эритроцитов, оценивается как титр реакции. Положительный результат реакции засчитывается, если в контрольной лунке эритроциты выпали на дно в виде пуговки или маленького колечка.
Если в контроле наблюдается агглютинация эритроцитов, значит в исследуемом материале содержатся компоненты, вызывающие неспецифическое склеивание бараньих эритроцитов. Неспецифическая гемагглютинация исказит (замаскирует) положительный результат реакции в случае одновременного присутствия в материале специфического антигена. В подобном случае исследуемый материал тщательно фильтруют, после чего повторно ставят РНАт. При постановке РНАт количество добавляемой в реакцию сыворотки чумной агглютинирующей должно соответствовать расчетному - 2 ГЕ в объеме 0,2 мл. Значительное завышение дозы сыворотки приведет к избытку ее в лунках, вследствие чего будет занижен титр реакции, а при исследовании материала с невысоким содержанием антигена может быть вообще получен отрицательный результат.
Для определения гемагглютинирующей единицы сыворотки в 6 лунок полистироловой пластинки наливают по 0,2 мл разводящей жидкости, в первую лунку добавляют 0,2 мл сыворотки чумной агглютинирующей в разведении 1:25 тыс. и титруют. Получают ряд разведений сыворотки: 1:50000; 1:100000; 1:200000 и т.д. Затем во все лунки добавляют по одной капле (0,03-0,05 мл) антигенного диагностикума. Разведение сыворотки в последней лунке с отчетливой гемагглютинацией и оценивается как 1 ГЕ. Например, последняя лунка с отчетливой гемагглютинацией - третья. Следовательно, 1 ГЕ содержится в 0,2 мл сыворотки в разведении 1:200000, а 2 ГЕ - в 0,2 мл сыворотки в разведении 1:100000. Чтобы приготовить рабочий раствор сыворотки для постановки РНАт (в приведенном примере), надо исходный раствор (1:25000) развести в 4 раза. Приготовленный рабочий раствор сыворотки обязательно контролируют.
Контроль ставят следующим образом. Первую лунку отведенного для контроля ряда оставляют пустой, а в последующие 4-5 лунок наливают по 0,2 мл разводящей жидкости. Затем в первую и вторую лунки наливают по 0,2 мл контролируемого раствора сыворотки и титруют, начиная со второй лунки (!). После этого во все лунки добавляют по 0,2 мл разводящей жидкости и по одной капле (0,03-0,05 мл) антигенного диагностикума. Пластинку встряхивают и оставляют до полного оседания эритроцитов. Если гемагглютинация произойдет только в первых двух лунках, значит концентрация рабочего раствора сыворотки рассчитана правильно.
Контроль рабочего раствора сыворотки повторяют одновременно с каждой постановкой реакций. Величину гемагглютинирующей единицы сыворотки определяют заново для каждой серии антигенного диагностикума и каждой серии сыворотки.
Рабочий раствор сыворотки для РНАт не подлежит длительному хранению, он должен быть использован в день приготовления.
Техника постановки серологических реакций в микрообъемах
Серологические исследования в микрообъемах осуществляют с помощью специального комплекта приспособлений - микротитратора. Микротитратор системы Такачи венгерского производства позволяет осуществлять титрование материала в объемах 0,025 мл и 0,05 мл. В комплект входят: пластинки из оргстекла с луночками, приспособления для титрования (титраторы) с платиновыми полыми головками, рассчитанными на 0,025 мл или на 0,05 мл, пипетки со сменными воронками-капельницами, имеющими калиброванное отверстие, рассчитанное на объем капли 0,025 мл.
С помощью микротитратора можно ставить как двухкомпонентные, так и трехкомпонентные реакции. Методика постановки реакций, т.е. последовательность всех операций, такая же, как и при проведении исследований в полистироловых пластинках.
Необходимо иметь в виду, что чувствительность микрометода обычно на одно разведение (т.е. в 2 раза) ниже, чем метода постановки реакции в объеме 0,2 мл.
Техника постановки реакций в микротитраторе состоит из следующих манипуляций. С помощью пипетки-капельницы вносят в каждую луночку разводящую жидкость в объеме одной капли (0,025 мл). Затем с помощью приспособления для титрования, имеющего головку объемом 0,025 мл, забирают исследуемый материал. Следует при этом помнить, что каждый раз перед началом работы надо обязательно обжечь на спиртовке головки титраторов. Чтобы взять материал, надо погрузить головку до половины в жидкость и убедиться в том что жидкость заполнила ее. Вынимая титратор из пробирки, нельзя прикасаться головкой к ее стенкам, т.к. при этом теряется часть взятого материала. При общем малом его объеме (0,025 мл) такие потери могут составлять существенную долю, что отразится на результате исследования. Вся эта манипуляция облегчается, если при взятии материала ручка титратора прижимается к горловине пробирки и скользит по ней.
Титратор с взятым материалом переносят в первую луночку и, придерживая его в вертикальном положении, делают несколько быстрых вращательных движений в обе стороны. Затем титратор переносят в соседнюю луночку и повторяют манипуляцию. При соответствующем навыке титрование можно проводить одновременно в нескольких рядах. Во время вращения центральный стержень титратора, проходящий через головку, упирается в дно луночки. После того как протитруют весь ряд, удаляют из полости головки оставшуюся жидкость. Для этого надо прикоснуться к смоченному дистиллированной водой хорошо отжатому ватному тампону. Затем титратор промывают в дистиллированной воде путем вращательных движений и после удаления из головки воды (с помощью уже другого, чистого тампона) обжигают ее на спиртовке. Можно перед обжиганием погрузить головку титратора в спирт.
По окончании титрования в луночки добавляют по одной капле (0,025 мл) соответствующих ингредиентов: при постановке РПГА - разводящую жидкость; при РТПГА - фракцию I с содержанием 20-40 ГЕ в капле; при РНАг - фракцию I с содержанием 2 ГЕ в капле; при РНАт - сыворотку чумную агглютинирующую с содержанием 2 ГЕ в капле. В случае постановки трехкомпонентных реакций пластинки выдерживают 30-40 минут при комнатной температуре. Затем в луночки добавляют с помощью пипетки-капельницы по одной капле (0,025 мл) соответствующего диагностикума. Концентрация диагностикумов для постановки реакций в микротитраторе должна быть 0,3% (т.е. 2,5%-ную взвесь эритроцитов дополнительно разводят в 8 раз). После добавления эритроцитов в лунки пластинку надо слегка потрясти путем легких ударов по ее ребру.
При определении гемагглютинирующих единиц (ГЕ) и приготовлении рабочих растворов антигена и сыворотки для РНАг и РНАт необходим особо строгий контроль правильности подобранной концентрации раствора. Надо иметь в виду, что, как правило, требуется делать поправку к расчетным данным в сторону некоторого увеличения концентрации рабочих растворов антигена и сыворотки (примерно в 1,5 раза против расчетной величины). Контроль рабочего раствора антигена или сыворотки повторяют каждый раз при постановке реакций и делают это следующим образом. Первую луночку отведенного для контроля ряда оставляют пустой, а в последующие 4-5 луночек вносят по одной капле (0,025 мл) разводящей жидкости. Затем в первую (пустую) луночку вносят каплю контролируемого раствора с помощью пипетки-капельницы, а во вторую - с помощью титратора, и титруют, начиная со второй луночки. Затем в каждую луночку добавляют по одной капле (0,025 мл) соответствующего диагностикума. Пластинку встряхивают и оставляют на ровном столе.
Учет и оценка результатов реакций проводится точно так же, как и при исследованиях в полистироловых пластинках.
В связи с тем, что в микрообъемах реакции завершаются быстрее, результат можно учитывать уже через час-полтора. В этом существенное преимущество постановки реакций в микротитраторе. Данный прием исследования особенно ценен при необходимости срочного диагноза. Второе важное его преимущество - экономия всех ингредиентов, используемых в реакциях, и прежде всего малая потребность в исследуемом материале. Последнее обстоятельство делает этот методический прием незаменимым для прижизненных наблюдений за продукцией и динамикой антител у животных и человека. Порой он оказывается единственно возможным методом - например, когда в наличии остается очень малое количество материала, а переконтроль исследования и подтверждение результата имеют принципиальное значение.
Однако у этого методического приема есть определенные недостатки. Постановка реакций в микрообъемах требует особой четкости и тщательности манипуляций и, в конечном счете, большого напряжения в процессе работы. При проведении массовых исследований это обстоятельство приобретает существенное значение.
Дополнительные контроли достоверности результатов реакций при поиске полноценного чумного антигена (фракции I)
Специальные контроли необходимы в тех случаях, когда в исследуемом материале подозревается присутствие сильнодействующих химических веществ, например дезинфектантов, что может исказить результат исследования. Установлено, что неблагоприятный фактор (дезинфектант), действуя на антитела, исключает возможность соединения их с гомологичным антигеном. Действие этого фактора не зависит от того, адсорбированы ли антитела на эритроцитах (в РПГА) или находятся в реагирующей смеси в свободном состоянии (в РНАт). Присутствие в исследуемом материале дезинфектанта может, таким образом, обусловить ложноотрицательный результат РПГА (выпадение эритроцитов в пуговки при наличии в материале антигена) и ложноположительный результат в РНАт (выпадение эритроцитов в пуговки при отсутствии антигена в материале). Обычные контроли к реакциям в таких случаях неэффективны.
В описанной ситуации дополнительно ставят следующие контроли.
Контроль достоверности отрицательного результата РПГА с антительным диагностикумом
После того, как проведен учет реакции, подлежащей контролю, пластинку встряхивают до полной гомогенизации содержимого лунок и добавляют в каждую лунку по 0,2 мл раствора фракции 1 или взвеси культуры такой концентрации, чтобы в этом объеме содержались 4-8 ГЕ. Пластинку оставляют на 3 часа при комнатной температуре, после чего проводят учет.
Если во всех лунках произойдет агглютинация эритроцитов, значит первоначальный отрицательный результат реакции был достоверным.
Если же во всех лунках эритроциты осядут на дно в виде пуговок - первоначальный результат реакции нельзя считать достоверным, поскольку такой результат контроля свидетельствует о присутствии в исследуемом материале сильнодействующего химического вещества.
Контроль достоверности положительного результата РНАт
Материал, подлежащий контролю, титруют в 6-12 лунках и затем в каждую лунку добавляют одновременно агглютинирующую чумную сыворотку в дозе 2 ГЕ и каплю антигенного диагностикума. Пластинку помещают сначала на 30 минут при температуре 4-6°, а затем на 3 часа при комнатной температуре, после чего проводят учет.
Если по сравнению с первоначальным результатом число лунок с пуговками уменьшится и соответственно увеличится число лунок с агглютинацией эритроцитов - первоначальный положительный результат реакции был достоверным. Механизм этого феномена состоит в том, что низкая температура, замедлив процесс специфической нейтрализации внесенных антител, обеспечивает возможность агглютинации эритроцитов, внесенных одномоментно с антителами, в большем числе лунок, чем в первоначальном исследовании при обычном режиме реакции.
Если картина контрольной реакции не отличается от первоначальной, результат исследования нельзя считать достоверным.
Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.