Приложение N 1. Методика постановки реакции гемагглютинации с определением цистеиноустойчивых антител

Приложение N 1
К Инструкции по выявлению, учету
и наблюдению за носителями
бактерий брюшного тифа и паратифов,
утвержденной Министерством
здравоохранения СССР

Методика
постановки реакции гемагглютинации с определением цистеиноустойчивых антител

В настоящее время известны антитела, относящиеся к 5 классам иммуноглобулинов - G, А, М, Д и Е. Наибольшее диагностическое значение при серологическом исследовании на бактерионосительство имеют IgG-антитела (с константой седиминтации 7S) и IgM-антитела (с константой седиментации 19S). Нормальные (так называемые неспецифические, анамнестические и прививочные антитела к полисахаридным антигенам тифозных и паратифозных бактерий принадлежат в основном к IgM. Эти же антитела появляются первыми на ранней стадии заболевания и лишь к концу первой недели болезни, а в ряде случаев и позже заметно нарастают IgG-антитела. Особенно значительно увеличивается удельное содержание в сыворотке IgG-антител при формировании острого и хронического бактерионосительства. В сыворотках хронических бактерионосителей в большинстве случаев отсутствуют или имеются в небольшом титре IgM-антитела, а основная масса антител представлена IgG и IgA, тогда как у транзиторных бактерионосителей определяются практически только IgM-антитела.

Установлено, что IgG-антитела относительно устойчивы к обработке сывороток некоторыми редуцирующими веществами и, в частности цистеином, тогда как IgM и IgA-антитела инактивируются этими реагентами. Это позволяет с помощью цистеина определить удельное содержание в сыворотке IgG-антител. Рекомендуется использовать L-цистеин солянокислый или свободный (чистый) отечественный или Reanal (Венгрия).

Для обработки сывороток готовят ex tempore раствор цистеина (15 мг на 1 мл растворителя). Солянокислый цистеин растворяют в 0,1 N растворе NaOH с таким расчетом, чтобы рН готового раствора был равен 7,0-7,2. "Свободный" цистеин сначала растворяют в небольшом количестве 0,1 N раствора NaOH и при значениях рН 7,0-7,2 доводят до нужного объема 0,85% раствором хлористого натрия. Контроль за рН раствора обязателен. Раствор цистеина может храниться не более 30-60 мин, поэтому сначала следует приготовить необходимые разведения сывороток.

Исследуемую сыворотку в разведении 1:5 смешивают с равным объемом раствора цистеина. Необходимые объемы исследуемой сыворотки и раствора цистеина рассчитывают, исходя из количества диагностикумов, используемых для титрования данной сыворотки. При титровании цистеиноустойчивых О-, Ви- и Н-антител требуется 0,1 мл цельной сыворотки и еще 0,1 мл для контроля без цистеина. Смесь сыворотки с раствором цистеина помещают в небольшие пробирки или флакончики и плотно закрывают их резиновыми пробками. Объем пробирок (или флаконов) должен быть таким, чтобы между содержимым и пробкой оставалось минимальное свободное пространство во избежание окисления цистеина кислородом воздуха. Пробирки с сыворотками, обработанными цистеином, выдерживают в течение ночи (примерно 18 часов) в термостате при 37°. В таких же условиях выдерживается вторая часть исследуемой сыворотки без цистеина, разведенная 1:10 0,85% раствором хлористого натрия. На следующий день обе части сыворотки титруют, начиная с разведения 1:20, в реакции пассивной гемагглютинации одним и тем же диагностикумом. При титровании большого числа сывороток целесообразно использовать шприц непрерывного действия типа "Рекорд" марки Ш-19, который снабжается специальным ограничителем (отрезок металлической трубки), надеваемым на стержень между поршнем и крышкой шприца. Длина ограничителя подбирается с таким расчетом, чтобы в шприц можно было набрать нужный объем жидкости (0,5 мл или 0,25 мл и т.п.). Для удобства при титровании на шприц можно надевать толстую иглу (например, для пункции). После титрования каждой сыворотки шприц 4-5 раз промывается дистиллированной водой.

В необработанной цистеином сыворотке определяется суммарный титр гемагглютининов, а в обработанный титр IgG-антител, устойчивых к цнстеину. Сравнивая полученные титры, можно получить примерное представление об удельном содержании в сыворотке IgG-антител.

При титровании сывороток, обработанных цистеином, необходимо использовать забуференный 0,85% раствор хлористого натрия (фосфатный буфер, рН = 7,0-7,2), однако предпочтительней готовить 0,85% раствор хлористого натрия на нормальной, прогретой при 56° в течение 30 мин сыворотке (кроличьей, лошадиной, крупного рогатого скота). Нормальную сыворотку добавляют из расчета 1 мл на 100 мл физиологического раствора при условии, что в этом разведении нормальной сыворотки будут отсутствовать антитела к применяемым диагностикумам, что проверяется предварительно для каждой новой серии сыворотки.

При постановке РПГА с цистеином нужно учитывать следующее. Особое значение при выявлении бактерионосителей имеет не столько абсолютный титр антител, сколько удельное содержание в сыворотке IgG-антител. Если обработка цистеином не снижает титр, либо снижает его только на одно или два разведения, то это говорит о значительном содержании в сыворотке IgG-антител. Например, титр Ви-антител в необработанной сыворотке 1:320, а в обработанной 1:160 или 1:80; титр суммарных О-антител - 1:160, a IgG - 1:80 или 1:40; титр суммарных Н-антител - 1:640, a IgG - 1:320 или 1:160. Такие результаты дают основание заподозрить острое или хроническое бактерионосительство. При этом следует учитывать, что у хронических бактерионосителей могут быть и более высокие, и более низкие титры, но разница между содержанием суммарных и IgG-антител должна быть минимальной, особенно для Ви- и Н-антител. В некоторых случаях у хронических носителей О-антитела могут быть чувствительны к цистеину, но Ви- и Н-антитела устойчивы. У небольшого количества бактерионосителей (5-10%) бактерии брюшного тифа могут не содержать Ви-антиген, вследствие чего отсутствуют Ви-антитела. В таких случаях оценивают только титр О- и Н-антител. Так же поступают при диагностике носителей паратифозных бактерий.

Если при обработке цистеином титр антител значительно снижается или цистеиноустойчивые антитела не определяется, то такое лицо, скорее всего не является хроническим бактерионосителем.

РПГА с цистеином может быть с успехом использована с целью дифференцировки транзиторных носителей от хронических, а также привитых от хронических и бактерионосителей, поскольку у привитых однократно или двукратно большая часть антител относятся к IgM, которые инактивируются цистеином.