Приложение N 1. Методика постановки реакции гемагглютинации с определением цистеиноустойчивых антител

Приложение N 1
К Инструкции по выявлению, учету
и наблюдению за носителями
бактерий брюшного тифа и паратифов,
утвержденной Министерством
здравоохранения СССР

Методика
постановки реакции гемагглютинации с определением цистеиноустойчивых антител

В настоящее время известны антитела, относящиеся к 5 классам иммуноглобулинов - G, А, М, Д и Е. Наибольшее диагностическое значение при серологическом исследовании на бактерионосительство имеют IgG-антитела (с константой седиминтации 7S) и IgM-антитела (с константой седиментации 19S). Нормальные (так называемые неспецифические, анамнестические и прививочные антитела к полисахаридным антигенам тифозных и паратифозных бактерий принадлежат в основном к IgM. Эти же антитела появляются первыми на ранней стадии заболевания и лишь к концу первой недели болезни, а в ряде случаев и позже заметно нарастают IgG-антитела. Особенно значительно увеличивается удельное содержание в сыворотке IgG-антител при формировании острого и хронического бактерионосительства. В сыворотках хронических бактерионосителей в большинстве случаев отсутствуют или имеются в небольшом титре IgM-антитела, а основная масса антител представлена IgG и IgA, тогда как у транзиторных бактерионосителей определяются практически только IgM-антитела.

Установлено, что IgG-антитела относительно устойчивы к обработке сывороток некоторыми редуцирующими веществами и, в частности цистеином, тогда как IgM и IgA-антитела инактивируются этими реагентами. Это позволяет с помощью цистеина определить удельное содержание в сыворотке IgG-антител. Рекомендуется использовать L-цистеин солянокислый или свободный (чистый) отечественный или Reanal (Венгрия).

Для обработки сывороток готовят ex tempore раствор цистеина (15 мг на 1 мл растворителя). Солянокислый цистеин растворяют в 0,1 N растворе NaOH с таким расчетом, чтобы рН готового раствора был равен 7,0-7,2. "Свободный" цистеин сначала растворяют в небольшом количестве 0,1 N раствора NaOH и при значениях рН 7,0-7,2 доводят до нужного объема 0,85% раствором хлористого натрия. Контроль за рН раствора обязателен. Раствор цистеина может храниться не более 30-60 мин, поэтому сначала следует приготовить необходимые разведения сывороток.

Исследуемую сыворотку в разведении 1:5 смешивают с равным объемом раствора цистеина. Необходимые объемы исследуемой сыворотки и раствора цистеина рассчитывают, исходя из количества диагностикумов, используемых для титрования данной сыворотки. При титровании цистеиноустойчивых О-, Ви- и Н-антител требуется 0,1 мл цельной сыворотки и еще 0,1 мл для контроля без цистеина. Смесь сыворотки с раствором цистеина помещают в небольшие пробирки или флакончики и плотно закрывают их резиновыми пробками. Объем пробирок (или флаконов) должен быть таким, чтобы между содержимым и пробкой оставалось минимальное свободное пространство во избежание окисления цистеина кислородом воздуха. Пробирки с сыворотками, обработанными цистеином, выдерживают в течение ночи (примерно 18 часов) в термостате при 37°. В таких же условиях выдерживается вторая часть исследуемой сыворотки без цистеина, разведенная 1:10 0,85% раствором хлористого натрия. На следующий день обе части сыворотки титруют, начиная с разведения 1:20, в реакции пассивной гемагглютинации одним и тем же диагностикумом. При титровании большого числа сывороток целесообразно использовать шприц непрерывного действия типа "Рекорд" марки Ш-19, который снабжается специальным ограничителем (отрезок металлической трубки), надеваемым на стержень между поршнем и крышкой шприца. Длина ограничителя подбирается с таким расчетом, чтобы в шприц можно было набрать нужный объем жидкости (0,5 мл или 0,25 мл и т.п.). Для удобства при титровании на шприц можно надевать толстую иглу (например, для пункции). После титрования каждой сыворотки шприц 4-5 раз промывается дистиллированной водой.

В необработанной цистеином сыворотке определяется суммарный титр гемагглютининов, а в обработанный титр IgG-антител, устойчивых к цнстеину. Сравнивая полученные титры, можно получить примерное представление об удельном содержании в сыворотке IgG-антител.

При титровании сывороток, обработанных цистеином, необходимо использовать забуференный 0,85% раствор хлористого натрия (фосфатный буфер, рН = 7,0-7,2), однако предпочтительней готовить 0,85% раствор хлористого натрия на нормальной, прогретой при 56° в течение 30 мин сыворотке (кроличьей, лошадиной, крупного рогатого скота). Нормальную сыворотку добавляют из расчета 1 мл на 100 мл физиологическог