Приложение. Метод определения лецитиназоактивных стафилококков

Приложение

Метод определения лецитиназоактивных стафилококков

Сущность метода заключается в концентрировании бактерий из определенного объема анализируемой воды на мембранные фильтры, выращивании их при на желточно-молочно-солевом агаре (ЖМСА) с полимиксином, подсчете лецитиназоактивных стафилококков.

Через мембранные фильтры профильтровывают 50 мл воды с таким расчетом, чтобы выросли изолированные колонии (например, 5 мл, 20 мл, 25 мл). Фильтры помещают в ЖМСА с полимиксином, не содержащий на поверхности следов влаги, выращивают при 20-24 часа. На эту среду при большом загрязнении стафилококками можно делать прямые посевы 1 мл и меньших объемов.

Подсчитывают количество выпуклых блестящих колоний, которые образовали характерный пигмент (золотистый, палевый, лимонно-желтый, реже белый) и радужную зону вокруг.

При необходимости подтвердить наличие стафилококков, обладающих лецитиназной активностью, подозрительные колонии пересевают "пятнами" на чашки, разделенные на квадраты, со средой того же состава, отмечают пигментообразование, радужную зону разложения желтка и зону помутнения, характерную для стафилококков форму клеток при микроскопировании.

При отсутствии мембранных фильтров можно определить стафилококки титрационным методом, используя в качестве среды накопления солевой бульон. Схема посева должна соответствовать таблице 1 ГОСТ 18693-73, по которой определяют индекс стафилококков. Высев из сред накопления делают на ЖМСА с полимиксином, отмечая наличие лецитизоактивных стафилококков.

Желточно-молочно-солевой агар (ЖМСА).

Сухой питательный агар - 55 г.

(Дагестанского НИИ питательных сред).

Натрий хлористый - 90 г.

Дистиллированная вода до 1000 мл.

Расплавляют при нагревании, разливают мерно в сосуды и стерилизуют при (1,1 ) 20 мин.

Перед употреблением, в расплавленный и охлажденный до 50-55# солевой агар добавляют (из расчета на 100 мл среды) стерильное обезжиренное молоко - 6 мл.

Один яичный желток, тщательно смешанный с 50 мл физиологического раствора с помощью стеклянных бус - 10 мл.

Полимиксин М (раствор хранить не более 14 дней) - 30000 ЕД.

Тщательно смешивают и разливают в чашки Петри толстым слоем по 20-25 мл для выращивания бактерий на мембранных фильтрах и тонким слоем по 15 мл для подтверждающего этапа.

Метод определения энтерококков в морской воде

Индекс энтерококков может быть определен методом мембранных фильтров или титрационным методом.

Метод мембранных фильтров

Сущность метода заключается в концентрировании бактерий из определенного объема анализируемой воды на мембранный фильтр, выращивании их на элективных средах при , дифференцировании выросших колоний и подсчете количества энтерококков.

Через мембранные фильтры профильтровывают:

- при исследовании воды бассейна - не менее 100 мл;

- при исследовании воды у водозабора - не менее 20 мл, с таким расчетом, чтобы на каждом из фильтров выросли изолированные колонии в количестве не более 50. При выборе объема ориентируются на результаты предыдущих исследований. (Например, для воды бассейнов могут быть выбраны следующие объемы: 10, 40, 50 мл; для воды у водозабора, 1, 5, 15 мл).

Фильтры помещают на элективную среду (Сланеца-Бертли или Турчинского) и выращивают при 24 часа.

Учет результатов

Подсчитывают колонии разной окраски и величины. По 3-4 колонии каждого типа пересевают секторами на чашки с подтверждающей средой (по 8-10 секторов на одну чашку). Рост на этой среде и характерная морфология клеток при микроскопии (полиморфные, как правило, слегка вытянутые диплококки) позволяет отнести такого типа колонии к энтерококкам. Для вычисления индекса энтерококков количество таких колоний в исследуемом объеме умножают на 1000 мл и делят на этот объем, соблюдая условия, оговоренные в п. 4.2.13 ГОСТа 18963-73 при вычислении коли-индекса.

Обильный рост колоний, редуцирующих ТТХ, т.е. с малиново-вишневым оттенком, свидетельствует о наличии в воде Str. faecalis - показателя свежего фекального загрязнения.

При работе на среде Турчинского после выращивания колоний непосредственно на мембранном фильтре выполняют каталазный тест путем нанесения петлей капли перекиси водорода на несколько колоний каждого типа. При образовании пузырьков газа такие колонии из учета исключают. Пересевают на подтверждающую среду только колонии, не обладающие каталазной активностью.

Среда Сланеца-Бертли (модификация)

Сухой питательный агар - 40 г

(Дагестанского НИИ питательных сред)

Калий фосфорнокислый однозамещенный - 4 г

Дистиллированная вода до 1000 мл

Расплавить при нагревании, установить рН 7,0, разлить мерно в сосуды, стерилизовать при (1,1 ) 20 мин.

Перед употреблением в расплавленный и слегка остуженный агар добавить из расчета на 100 мл среды:

Глюкозы - 0,4 г

Азид натрия - 0,04 г

ТТХ (1% водный раствор) -1 мл

Полимиксин М

(срок хранения раствора не более 14 дней) - 30000 ед.

Тщательно смешать, исправить рН-6,9, разлить в чашки толстым слоем по 20-25 мл. Хранить в холодильнике не более 3-х суток.

Среда Турчинского

Дистиллированная вода - 600 мл

Желчь крупного рогатого скота - 400 мл

Сухой питательный агар Дагестанского НИИ питательных средств 35-40 г

Калий фосфорнокислый двузамещенный - 5 г

Калий фосфорнокислый однозамещенный - 5 г

Натрий-аммоний фосфорнокислый - 5 г

Расплавить при нагревании, установить рН 7,2-7,4, разлить мерно в сосуды, простерилизовать при (1,1 ) 20 мин.

Перед употреблением в расплавленный и слегка охлажденный агар добавить из расчета на 100 мл среды:

Глюкозы - 0,5 г

ТТХ (1% водный раствор) -1 мл

1 % водный раствор метиленового синего (хранить не более 14 дней) - 0,6 мл

Полимиксин - 30000 ед.

Фурациллин (0,1% спиртовой раствор) - 1,2 мл

Тщательно смешать, разлить в чашки толстым слоем по 20-25 мл. Хранить в холодильнике не более 3-х суток.

Подтверждающая среда

Сухой питательный агар Дагестанского НИИ питательных сред - 50 г

Натрий хлористый - 65 г

Вода дистиллированная - 1000 мл

Расплавить при нагревании, установить рН 6,2 разлить мерно в сосуды, простерилизовать при (1,1 ) 30 мин.

Перед употреблением в растопленный агар добавить из расчета на 100 мл среды:

Глюкозы - 1 г

ТТХ (1% водный раствор) - 1 мл

Кристаллический фиолетовый (0,01% водный раствор) - 1,25 мл

Полимиксин - 30000 ед.

Тщательно смешать, разлить в чашки. Хранить в холодильнике не более 3-х суток.

Титрационный метод

Титрационный метод менее точен, чем метод мембранных фильтров, однако при их отсутствии может быть рекомендован для использования.

Для определения количества энтерококков можно воспользоваться посевами в глюкозо-пептонную среду накопления, которые были сделаны для определения бактерий группы кишечных палочек. (Глюкозо-пептонную среду в этих случаях следует готовить без индикатора бромтимолблау).

Из сосудов, где отмечены признаки роста, делают высев одновременно на среду Эндо и на сектора среды Сланеца-Бертли, (по 6 секторов). Рост на секторах среды Сланеца-Бертли указывает на наличие энтерококков. При необходимости наличие энтерококков подтверждают микроскопией выросших колоний.

Индекс энтерококков рассчитывают по таблице 1 ГОСТ 18963-73.

При отсутствии азида натрия допустимо использовать в качестве подтверждающих другие среды (Турчинского, молочно-ингибиторную). Среды без азида натрия менее элективны в отношении посторонней кокковой микрофлоры, поэтому необходима более тщательная идентификация выросших колоний (Каталазный тест и микроскопия).

На сектора необходимо делать массивный высев большой петли материала из сред накопления. В то же время, к концу штриха должны быть получены изолированные колонии, иначе более грубый рост посторонних бактерий будет маскировать единичные нежные колонии энтерококков.

Каталазный тест можно выполнять на предметном стекле, нанося испытуемую культуру большой точкой. Слегка подсушив препарат на воздухе, накапывают петлей перекись водорода. Положительный каталазный тест отмечают при образовании пузырьков газа, наблюдаемых с лупой или с помощью вогнутого зеркала.