Приложение N 2. Выявление вируснейтрализующих противооспенных антител в реакции нейтрализации на куриных эмбрионах (методом подсчета оспин)

Приложение N 2

Выявление вируснейтрализующих противооспенных антител в реакции нейтрализации на куриных эмбрионах (методом подсчета оспин)

Реакция используется для обнаружения в сыворотках людей вируснейтрализующих антител к вирусам оспы и вакцины. В реакции участвуют два компонента: исследуемая сыворотка и вирус осповакцины (в виде оспенной вакцины или хорионаллантоисной культуры).

Предварительным титрованием на хорионаллантоисной оболочке (ХАО) 12-дневных куриных эмбрионов (КЭ) устанавливают рабочую дозу вируса. Для этого готовят десятикратные разведения вируссодержащей взвеси на буферном растворе Мак-Ильвейна (способ приготовления буферного раствора прилагается). Начиная с наивысшего, каждым разведением заражают по 6 эмбрионов.

Зараженные КЭ инкубируют 18 часов при 39°, по истечении этого срока вскрывают и извлекают ХАО. Последние после отмывания просматривают на черном фоне при боковом освещении и подсчитывают количество оспин, развившихся на каждой оболочке. Затем вычисляют среднее арифметическое количество оспин для каждого исследованного разведения.

Для постановки реакции нейтрализации выбирают разведение вируссодержащей взвеси, которое будучи разведено вдвое (взаимное разведение при соединении с сывороткой) давало бы 40 - 50 оспин.

Перед исследованием испытуемые сыворотки прогревают при 56° в течение 30 минут и готовят двукратные разведения (с 1:5 или 1:20 до 1:80 или 1:320) сывороток на буферном растворе Мак-Ильвейна к каждому разведению сыворотки добавляют равный объем вируссодержащей взвеси в выбранном рабочем разведении и оставляют для контакта при температуре 37° на 2 часа. Эмбрионы заражают по 0,1 мл смеси, при этом используют по 5-6 КЭ на каждое разведение сыворотки.

Эмбрионы готовят к заражению следующим образом. Во время просмотра (свет должен падать сверху на тупой конец яйца) делают отметку простым карандашом в центре воздушного мешка. Затем поворачивают яйцо острым концом вверх и замечают место, где белок занимает наибольшее пространство. На противоположной этому месту стороне делают отметку для пропиливания, выбирая участок между двумя сосудами и их ответвлениями. Метка должна ставиться между ветками соседних вен, но не на самих сосудах.

Пропиливание осуществляется сепарационным вулканитовым диском бормашины. Одно отверстие пропиливают в центре воздушного мешка, второе - очень осторожно во избежание кровоизлияний - по отметке на боковой стороне яйца. Необходимо следить, чтобы была пропилена скорлупа и не затронута подскорлупная оболочка. Величина отверстий: длина - 3-4 мм, ширина - 1,5 мм. После пропиливания отверстий яйца укладывают на бок таким образом, чтобы отверстие на боковой поверхности было обращено вверх.

Подскорлупную оболочку в отверстии в центре воздушного мешка прорывают изогнутой хирургической иглой. Затем на второе отверстие, расположенное на боковой стороне яйца заносят 0,1 буферного раствора подогретого (в водяной бане) до 50° и той же иглой очень осторожно расслаивают (продавливают) подскорлупную оболочку для образования маленькой щели. После этого практически вся капля буферного раствора проходит под подскорлупную оболочку и частично отслаивает ХАО. Полное опускание мембраны происходит после отсасывания воздуха с помощью резиновой груши через отверстие в центре естественного воздушного мешка. Для контроля наличия и величины искусственных воздушных мешков яйца снова просвечивают и отбрасывают все имеющие кровоизлияния, с воздушным мешком под хорионаллантоисной мембраной.

Для заражения подготовленные яйца (с опущенной хорионаллантоисной мембраной) должны находится в термостате 2 часа.

После введения инокулята материал равномерно распределяют по оболочке осторожным круговым вращением яйца. Отверстие на боковой стороне яйца заклеивают липким пластырем в виде петли. Яйца укладывают на бок вверх заклеенным отверстием. Через 40 часов инкубации при 39° эмбрионы вскрывают. При вскрытии, держа яйцо одной рукой за петлю, разрезают скорлупу по длинной оси яйца и отслаивают участок мембраны, выстилающий искусственный воздушный мешок. Промывание, просмотр и подсчет оспин описаны выше. Проводят вычисление средних арифметических количеств оспин для каждого разведения сыворотки.

Контролем служит количество оспин, развившееся от нанесения на мембрану вируса в рабочем разведении, соединенного с равным количеством сыворотки человека, не содержащей противооспенных антител.

За титр сыворотки принимают ее конечное разведение, дающее нейтрализацию не менее 50% оспин, образуемых данным разведением вируссодержащей взвеси.

Состав фосфатно-цитратного буфера Мак-Ильвейна 0,004 Молярного раствора.

Раствор N 1 - лимонная кислота 0,84 г/л

Раствор N 2 - 0,712 г/л

Для получения буферного раствора РН 7,2 следует смешать оба раствора в соотношении: раствор N 1 - 2,6 мл и раствор N 2 - 17,2 мл.