Приложение 1. Питательная среда для получения споровой культуры Вас. anthracis

Приложение 1

Питательная среда для получения споровой культуры Вас. anthracis

Среда из казеинового перевара рН = 7,2 - 7,4.

Основой среды является триптический перевар казеина, к которому добавляют разбавленный водяной экстракт дрожжей и минеральные соли, играющие важную роль в питательных потребностях возбудителя сибирской язвы.

На этой среде получают спорообразование в 90 - 95%.

Рецепт приготовления казеинового перевара.

Состав среды:

Казеин 200,0 г

Натрий углекислый кристаллический ( ) 20,0 г

Суспензия размолотой поджелудочной железы 100,0 г

Хлороформ 10,0 мл

Вода 200,0 мл

Изготовление суспензии поджелудочной железы:

С трех килограммов поджелудочной железы удаляют жир. Затем ее тонко размалывают, взвешивают, помешают в бутыль, куда добавляют воду в количестве, в три раза превышающем ее вес, резко встряхивают и добавляют алкоголь до 25%. Перед использованием суспензию тщательно взбалтывают.

Приготовление казеинового перевара:

Казеин и углекислую соду помещают в колбу или бутыль, добавляют двумя порциями воду, подогретую до 37°С, после каждого добавления воды содержимое бутыли хорошо взбалтывают, добавляют суспензию размолотой поджелудочной железы и хлороформ, снова хорошо взбалтывают. Устанавливают рН = 7,4 - 7,5. Помещают на 16 дней в термостат при температуре 37°С, ежедневно взбалтывают. Ежедневно берут образцы и устанавливают рН = 7,4 - 7,5. После удаления из термостата среду два дня отстаивают и отфильтровывают кристаллы тирозина, которые остаются в виде белого осадка.

К двум литрам фильтрата добавляют 15 мл концентрированной соляной кислоты, растворенной в 150 мл воды, и кипятят 60 мин. Полученный перевар охлаждают, профильтровывают и устанавливают реакцию до рН = 7,4 (требуется 6 - 7 мл 40%-ного раствора NaOH). Поместив перевар в колбу или бутыль, добавляют 1% хлороформа, быстро несколько раз взбалтывают его, чтобы хлороформ эмульгировался, и хранят в темном месте.

Водный экстракт дрожжей:

Для состава нужно взять пищевых дрожжей 125 г, воды дистиллированной 1000 мл. Смешать дрожжи с водой в колбе и кипятить, непрерывно размешивая до прекращения пены; профильтровать на фильтре через пластинки. Добавить 1% хлороформа, хранить в колбах или бутылях в темноте, периодически взбалтывая.

Для массового производства колбы ставят на ночь на холод. Утром прозрачный слой сифонируют и одну емкость, а затем фильтруют.

На изготовление одного литра среды берут:

Среды казеинового триптического перевара 50 мл

Водного экстракта дрожжей 200 мл

7+ калия фосфорнокислого двузамещенного () 5 г

6+ калия фосфорнокислого однозамещенного () 1 г

5+ сернокислого натрия () 0,3 г

4+ хлористого кальция () 0,1 г

3+ сернокислого марганца () 0,03 г

2+ сернокислой магнезии () 0,05 г

1+ сернокислого железа () 0,01 г

Агара 30,0 г

Воды дистиллированной до 1000,0 мл

Примечание: 1. Взамен дрожжевого экстракта можно использовать 0,5%-ный раствор дрожжей "Бакто".

2. Соли, отмеченные знаком "+", могут быть опущены.

3. Арабские цифры от 7 до 1 обозначают порядок растворения солей.

4. Натрий фосфорнокислый не следует использовать взамен солей калия.

Среду с помощью фосфатного буфера доводят до pH = 7,2.

Пшеничный агар:

1 кг пшеничной крупы "Артек" или "Полтавской" залить 2 л дистиллированной воды. На следующий день воду слить и довести до первоначального объема, добавить 2,5% агар-агара, отделить осадок. Установить рН = 7,4. Стерилизация дробная, в аппарате Коха по 1,5 часа текучим паром в течение 3 дней.